橡膠樹甲基化過(guò)濾文庫(kù)的構(gòu)建與生物信息學(xué)分析.pdf

1、橡膠樹(Hevea brasiliensi)是大戟科的木本經(jīng)濟(jì)植物,所生產(chǎn)的天然橡膠是一種重要的戰(zhàn)略物資,在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中具有不可替代的地位。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)的快速發(fā)展,天然橡膠需求量大幅度增加,我國(guó)天然橡膠供不應(yīng)求。與水稻小麥等農(nóng)作物相比,橡膠樹分子生物學(xué)研究較為滯后。如何有效獲取大量的基因組信息,高效篩選縮短育種周期、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗性等與育種密切相關(guān)基因,及其功能基因組學(xué)研究是今后橡膠樹基因組學(xué)研究的重點(diǎn)。
　　 基因組文庫(kù)

2、是進(jìn)行基因組研究的基礎(chǔ)工作之一,其主要應(yīng)用于重要基因的克隆,基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控的研究,探索基因的結(jié)構(gòu)和組成,基因組物理圖譜的構(gòu)建及基因組的測(cè)序。橡膠樹基因組結(jié)構(gòu)復(fù)雜,重復(fù)序列含量高達(dá)52％,用常規(guī)構(gòu)建基因組文庫(kù)法(如Shotgun)則會(huì)增加測(cè)序成本,增加拼接錯(cuò)誤率及降低篩選基因效率。cDNA文庫(kù)則由于組織特異性和時(shí)空表達(dá)特異性,需要構(gòu)建多個(gè)cDNA文庫(kù)才能覆蓋整個(gè)基因組信息。
　　 甲基化過(guò)濾文庫(kù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)基因富集技術(shù)

3、,本研究利用大腸桿菌McrBC限制修飾系統(tǒng)構(gòu)建了巴西橡膠樹基因組甲基化過(guò)濾文庫(kù),并對(duì)大規(guī)模測(cè)序后所得數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。獲得主要結(jié)果如下:
　　 該文庫(kù)未擴(kuò)增和擴(kuò)增后的滴度分別為2.6×106pfu/mL和9×109pfu/mL,隨機(jī)挑選22個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定,DNA片段大小在1.0-2.5kb之間,陽(yáng)性克隆率為86.4％。適合大規(guī)模測(cè)序需要,是開展橡膠樹功能基因組學(xué)研究的寶貴資源。
　　 試驗(yàn)從文庫(kù)中隨機(jī)挑選

4、白色克隆進(jìn)行測(cè)序,去除低質(zhì)量序列,共獲得有效序列4819條。將這些序列進(jìn)行拼接,獲得913個(gè)contigs和1748個(gè)singlets,共計(jì)2661條獨(dú)立基因(Unigene),其中拼接最長(zhǎng)的序列長(zhǎng)為17954bp。GC含量統(tǒng)計(jì)表明,所得序列中GC堿基平均含量為35.86％,低于AT堿基含量(64.14％),推測(cè)與大腸桿菌McrBC限制修飾系統(tǒng)有關(guān)。
　　 將獲得的2661條非冗余序列進(jìn)行blast相似性搜索,結(jié)果表明54.31