大豆miRNA的鑒定與在抗疫霉根腐病中的功能分析.pdf

1、由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann，P.sojae)引起的大豆疫霉根腐病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性土傳病害之一。研究大豆疫霉根腐病的抗病機制，是培育廣譜、穩(wěn)定、高效、持久抗病品種的基礎(chǔ)。microRNA(miRNA)是真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼小分子RNA，通過堿基互補配對的方式識別靶標(biāo)mRNA，并根據(jù)互補程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶標(biāo)mRNA或者抑制靶標(biāo)mRNA的

2、翻譯。miRNA在植物生長發(fā)育和病害防御中起著重要的作用。
　　 本研究首先證明植物基因沉默系統(tǒng)對卵菌的抗性具有重要的作用。利用同源搜索方法對栽培大豆中的miRNA進(jìn)行預(yù)測;以大豆疫霉根腐病抗病、耐病和感病品種為材料，通過人工接種和miRNA芯片技術(shù)，鑒定與大豆疫霉菌侵染相關(guān)和抗病類型相關(guān)的miRNA;通過生物信息學(xué)方法預(yù)測miRNA的靶標(biāo)基因并進(jìn)行功能分析。根據(jù)miRNA在抗病、耐病和感病材料之間的表達(dá)差異，分析miRNA在抗

3、大豆疫霉根腐病途徑中的機制和作用，為培育和改良大豆疫霉根腐病抗性品種奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.植物基因沉默系統(tǒng)對卵菌抗性的作用利用煙草疫霉菌Pp025和辣椒疫霉菌Pc35接種擬南芥基因沉默突變體zippy、ago1-27、sgs3-11、rdr6-11，發(fā)現(xiàn)突變體的抗病性與野生型相比，略有增強。利用煙草瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將p19注射至煙草葉片，然后接種Pp025，發(fā)現(xiàn)與對照GFP相比，病斑長度明顯增長。利用發(fā)根農(nóng)桿菌K

4、599介導(dǎo)的大豆瞬時轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將p19轉(zhuǎn)入大豆，然后接種大豆疫霉菌P6497，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化p19的陽性根毛對疫霉菌的抗病性有輕微的下降。結(jié)果初步顯示，植物的基因沉默系統(tǒng)與卵菌抗性之間存在著密切的關(guān)系。
　　 2.栽培大豆中miRNA的預(yù)測通過比對擬南芥、水稻、苜蓿等所有植物中已知的miRNA成熟體序列與栽培大豆的EST序列，經(jīng)過層層嚴(yán)格篩選，鑒定到48條新的miRNA，并利用RT-PCR對預(yù)測的部分miRNA進(jìn)行實驗驗證。使用植物靶

5、基因預(yù)測軟件psRNAtarget，將該48個miRNA與大豆的基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，尋找可能的靶標(biāo)基因，一共獲得323個潛在的miRNA靶標(biāo)。根據(jù)基因的功能注釋，發(fā)現(xiàn)靶基因編碼產(chǎn)物類型多樣，其中包括轉(zhuǎn)錄因子、抗性蛋白等。同時還分析了包含有候選miRNA的EST的來源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有部分EST與脅迫響應(yīng)有關(guān)，推測來源于這些EST的miRNA可能受脅迫的調(diào)控。
　　 3.大豆中保守miRNA的表達(dá)分析選擇7個保守的miRNA進(jìn)行表達(dá)分

6、析。8個大豆品種進(jìn)行大豆疫霉菌P6497處理，通過Northern blotting技術(shù)，對這7個miRNA進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有6個miRNA在這8個品種中都有表達(dá)。
　　 4.與大豆疫霉菌侵染相關(guān)和抗性相關(guān)的miRNA的鑒定為了鑒定與大豆疫霉菌侵染相關(guān)的miRNA，我們利用生物芯片檢測了三個對P6497具有不同抗性反應(yīng)的大豆品種(Williams，感病品種;Conrad，耐病品種;Williams82，抗病品種，含有Rps1

7、-k)接種P.sojae前后miRNA的表達(dá)模式，找到97個受P.sojae調(diào)控的miRNA，同時分析了與抗性類型相關(guān)的miRNA。利用qRT-PCR對芯片中有顯著表達(dá)的9個miRNA進(jìn)行了驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)定量結(jié)果與芯片結(jié)果的一致性較高。
　　 5.miRNA靶基因的預(yù)測及功能分析通過BLAST比對，對miRNA的靶標(biāo)進(jìn)行預(yù)測，并與前人已發(fā)表的大豆-大豆疫霉菌互作的基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，找到與miRNA表達(dá)趨勢相反的靶標(biāo)基因，并利

8、用實時定量PCR方法進(jìn)行驗證。利用Gateway技術(shù)將與卵菌侵染顯著相關(guān)的10個miRNA前體構(gòu)建至植物表達(dá)載體pEarleyGate103中，并在煙草和大豆中進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，初步結(jié)果表明過表達(dá)miRNA能影響大豆疫霉菌的致病性。
　　 通過上述研究，我們初步明確了植物基因沉默系統(tǒng)在抗卵菌病害過程中具有重要作用，鑒定了48個大豆新型miRNA并對它們的特性進(jìn)行了分析，同時利用基因芯片技術(shù)分析了所有已知植物的miRNA在大豆不同抗性