一種與小麥葉片衰老相關(guān)的絲氨酸型蛋白酶的純化及其生化特性鑒定.pdf

1、以離體暗誘導(dǎo)衰老48 h的揚(yáng)麥158（Triticum aestivum L.cv.Yangmai158）葉片為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)鹽析、層析和電泳等方法分離純化得到了一種與葉片衰老相關(guān)的絲氨酸型蛋白酶（內(nèi)肽酶），然后對(duì)其生化特性和一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。其主要研究結(jié)果簡(jiǎn)述如下：
　　 1.蛋白酶的分離純化與質(zhì)譜鑒定
　　 暗誘導(dǎo)衰老的小麥葉片冰浴中研磨成勻漿后離心取上清液（即粗酶液），粗酶液于50℃，pH5.5的條件下溫浴處理0

2、.5 h，粗酶液中熱不穩(wěn)定性雜蛋白（尤其是1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶，Rubisco）的含量明顯減少；溫浴處理后的粗酶液經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)沉淀（飽和度為50％-70％）和Sephadex G-25層析脫鹽后，再通過(guò)Q-sepharosefast flow強(qiáng)陰離子交換層析（0到0.6 mol·L-1 NaCl梯度洗脫）分離，收集有目的蛋白酶活性的洗脫液再超濾脫鹽；上述具有蛋白酶活性的洗脫液分別經(jīng)過(guò)5％-20％的含明膠的梯度凝膠活性電泳

3、（gelatin-gradient-PAGE）和5％-20％的天然梯度凝膠電泳（natural gradient-PAGE）分離后，從活性電泳凝膠上的蛋白酶活性帶對(duì)應(yīng)的天然梯度凝膠上切下相應(yīng)位置附近的四條蛋白條帶（從上到下分別標(biāo)注為：1、2、3和4號(hào)），再分別加細(xì)胞提取液研磨成勻漿離心后回收，作為蛋白酶電泳樣品。上述樣品再分別通過(guò)gelatin-gradient-PAGE和native gradient-PAGE分析，結(jié)果顯示，從nat

4、ive膠上分別切下的4條蛋白帶銀染后顯示為四種蛋白，蛋白酶的活性電泳結(jié)果顯示僅2號(hào)蛋白帶具有蛋白酶活性。同時(shí)，四條蛋白帶送北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院蛋白質(zhì)組研究中心進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，所得數(shù)據(jù)在NCBI上進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，2號(hào)蛋白是屬于枯草桿菌類蛋白酶類（subtilisin-like）的一種蛋白酶。
　　 2.蛋白酶的生化特性分析鑒定
　　 對(duì)純化得到的蛋白酶進(jìn)行相關(guān)生化特性分析鑒定，結(jié)果顯示：絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF和PMS

5、F幾乎能完全抑制該枯草桿菌類蛋白酶的活性，且金屬離子蛋白酶抑制劑EGTA也可以抑制該酶的大部分活性（活性下降為原來(lái)的30％左右），表明該蛋白酶是一種依賴金屬離子的絲氨酸型蛋白酶。其他類型的蛋白酶抑制劑酸性蛋白酶抑制劑，如pepstatin、金屬離子型蛋白酶抑制劑EDTA和1，10-phenanthroline、半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64、絲氨酸蛋白酶抑制劑TPCK、半胱氨酸/絲氨酸蛋白酶抑制劑leupeptin對(duì)該酶抑制效果均不明顯；

6、該酶的最適pH在7左右，最適溫度為50℃左右；在70℃時(shí)處理1 h下仍有20％左右的活性；為了進(jìn)一步研究該枯草桿菌類蛋白酶的特性，我們又選用了九種有機(jī)試劑對(duì)蛋白酶進(jìn)行處理，結(jié)果顯示該酶對(duì)1％SDS、25％Ethanol、25％DMSO、0.2％Tween80和0.2％TritonX-100都不敏感，1M Urea可以使該蛋白酶活性降低30％左右，25％Isopropanol可以使該酶活性下降50％左右，而80mM DTT和25％meth