三角紫葉酢漿草葉色變異株系的組織培養(yǎng)與RAPD和ISSR標(biāo)記鑒定.pdf

1、本研究以三角紫葉酢漿草葉色變異株系為材料，研究其組織培養(yǎng)技術(shù)體系，并以野生型材料為對照，用RAPD和ISSR標(biāo)記對其進(jìn)行DNA檢測鑒定。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.形態(tài)發(fā)生能力：比較繼代1次、5次和10次材料，葉片和葉柄的不定芽和愈傷組織的分化率均隨繼代次數(shù)增加而降低，不定根發(fā)生率隨繼代次數(shù)增加而升高。連續(xù)繼代10次以內(nèi)，選擇葉片做外植體（培養(yǎng)物）更有利于保持相對穩(wěn)定的愈傷組織和不定芽分化能力。
　　 2.增殖：TDZ

2、能明顯促進(jìn)變異株系芽苗的增殖，增殖效果隨其濃度增加而增加。一定量的TDZ能顯著提高變異株系芽苗葉片花色素苷的積累。
　　 3.壯苗：適當(dāng)提高不含生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的MS培養(yǎng)基中的磷、鉀元素含量有利于芽苗的生長和葉片花色素苷的積累。當(dāng)培養(yǎng)基中KH2PO4的濃度為680mg/L（即4倍磷鉀元素含量）時，試管苗的苗重、苗高和葉片數(shù)均達(dá)最大值。
　　 4.生根培養(yǎng)與鱗莖發(fā)生：NAA作用優(yōu)于IBA，但兩者配合使用效果最好。培養(yǎng)基中不加入

3、6-BA有利于增加發(fā)根數(shù)和鱗莖數(shù)。最佳生根和鱗莖誘導(dǎo)配方均為：1/2MS+NAA0.2mg/L+IBA0.2mg/L(蔗糖40g/L，瓊脂粉7g/L,pH5.8～6.0)。
　　 5.煉苗移栽：變異株系的生根苗和帶根鱗莖的移栽成活率都很低，分別為2.56％和27.27％。
　　 6.蔗糖濃度對野生型和變異型材料葉片顏色的影響：三角紫葉酢漿草野生型和變異型材料的葉片顏色對蔗糖濃度變化都很敏感。(1)野生型葉綠素總量、葉綠素

4、a含量、葉綠素b含量以及Chla/Chlb的比值均隨蔗糖濃度提高而迅速升高；除Chla/Chlb比值有所下降外，上述其他指標(biāo)數(shù)值均在蔗糖濃度高于30g/L后逐漸趨于穩(wěn)定。變異型材料的葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b含量以及Chla/Chlb比值隨蔗糖濃度升高均沒有顯著的變化。類胡蘿卜素含量變化趨勢與葉綠素基本一致。不同的是，變異型的類胡蘿卜素含量也隨蔗糖濃度提高而顯著升高，但其增長幅度遠(yuǎn)低于野生型。相同蔗糖濃度下，變異型的上述所有色素指標(biāo)

5、的數(shù)值都遠(yuǎn)低于野生型。(2)野生型和變異型材料的花青素含量隨蔗糖濃度增加而顯著升高。蔗糖濃度為10～30g/L，野生型的增長速率大于變異型，超過30g/L后，野生型增長速率逐漸緩慢，而變異型出現(xiàn)并保持指數(shù)型增長趨勢。
　　 7.采用改良CTAB法提取材料的DNA。優(yōu)化了三角紫葉酢漿草的RAPD反應(yīng)體系，首次建立并系統(tǒng)優(yōu)化了三角紫葉酢漿草ISSR反應(yīng)體系和擴(kuò)增參數(shù)。優(yōu)化后的RAPD反應(yīng)體系為：反應(yīng)液的總體積25μl,10×Buff

6、er2.5μl，Mg2+濃度2.0mmol/L，Taq酶1U，引物濃度0.3μmol/L,dNTPMixture0.25mmol/L，模板DNA80～100ng。RAPD-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性45s,37℃退火1min,72℃延伸1.5min，40次循環(huán)；72℃延伸5min；4℃保存。優(yōu)化后的ISSR反應(yīng)體系為：25μl反應(yīng)液體系中含10×Buffer2.5μl,Mg2+濃度1.25mmol/L,Taq酶0

7、.9U，引物濃度0.3μmol/L,dNTPMixture0.25mmol/L，模板80ng。ISSR-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性Smin；94℃變性50s，退火時間60s（不同引物的退火溫度不同），72℃延伸1.5min，40次循環(huán)；72℃延伸7min；4℃保存。
　　 8.RAPD和ISSR檢測結(jié)果表明，在本研究涉及的引物檢測范圍內(nèi)，變異株系繼代5次與繼代10次材料的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物之間沒有明顯的差異，野生型花紋葉片

8、材料與無花紋葉片材料的擴(kuò)增結(jié)果之間也沒有顯著的差異。
　　 9.從70個RAPD隨機(jī)引物和100個ISSR隨機(jī)引物中分別篩選出2個RAPD特異引物(S76,S118)和2個ISSR特異引物(UBC818，UBC868)，分別擴(kuò)增出114和96個片段，多態(tài)性片段數(shù)為18和12，多態(tài)性百分率為15.79％和12.50％。其中差異性條帶有5種，均能區(qū)分野生型和變異株系。變異株系的差異性缺失帶S118700-800測序結(jié)果序列包含編碼葉