外源基因GAFP提高水稻紋枯病抗性的效應(yīng)研究.pdf

1、水稻原產(chǎn)亞熱帶，是中國乃至世界的重要糧食作物之一，也是我國一半以上人口的主糧。而紋枯病是水稻的三大病害之一，俗稱爛腳病，花腳桿。隨著植株矮化，栽培密度和施肥水平的提高，紋枯病的危害日益加重。根據(jù)調(diào)查顯示，紋枯病已經(jīng)成為了中國南方部分水稻種植區(qū)的第一大病害，嚴(yán)重威脅著水稻的產(chǎn)量。本研究從天麻中分離得到天麻抗真菌蛋白（簡稱GAFP）及其3個同源序列，并通過添加信號肽進(jìn)行載體優(yōu)化，共構(gòu)建了8個植物轉(zhuǎn)化載體。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入到徐稻3號和R6

2、547中，并通過組培手段得到轉(zhuǎn)化苗，然后進(jìn)行分子檢測和田間鑒定，確定其是否能提高水稻對紋枯病的抗性。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴徐稻3號的培養(yǎng)基的選擇:徐稻3號在N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷組織結(jié)構(gòu)致密、顏色為嫩黃色、呈顆粒狀、表面光滑、生長旺盛。而在MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色為暗黃色、呈不分散的表面水漬狀，不利于繼代培養(yǎng)。所以選擇N6培養(yǎng)基。⑵添加ABA對水稻成熟胚愈傷組織的影響:與不添加ABA相比，添加ABA可有效的抑制胚芽生長

3、，并有利于胚性愈傷的形成，獲得的愈傷組織結(jié)構(gòu)致密，質(zhì)地堅硬，表面有突起，呈乳白色，并稍提高其成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)率。⑶水稻愈傷組織對篩選劑G418的敏感測驗(yàn):，R6547的愈傷組織比徐稻3號的愈傷組織對G418更敏感。徐稻3號的愈傷組織在添加350mg/L的G418時對本身產(chǎn)生傷害，但是添加50-150mg/L時，對愈傷組織沒有選擇的作用，所以在250mg/L的G418時，是選擇抗性愈傷組織的最適濃度，所以本試驗(yàn)徐稻3號的G418一篩濃

4、度為150mg/L，二篩濃度為250mg/L;同理R6547的G418一篩濃度為100mg/L，二篩濃度為150mg/L。⑷通過PCR檢測陽性轉(zhuǎn)化子和陽性純系;然后進(jìn)行Southern雜交證實(shí)基因已經(jīng)整合到受體基因組中及其拷貝數(shù);實(shí)時定量PCR檢測其相對表達(dá)量。⑸徐稻3號和R6547有7個載體的轉(zhuǎn)化后代進(jìn)入T2代抗性鑒定試驗(yàn)，這7個載體分別為G1、G2、SG2、G3、SG3、G4、SG4，共計116個純合轉(zhuǎn)化株系參試。研究發(fā)現(xiàn)，與對照相