孔雀草試管開花條件的優(yōu)化及其分子機(jī)制研究.pdf

1、孔雀草（Tagetes patula L.）屬于菊科萬壽菊屬一年生草本植物，是重要的觀賞花卉，有較高的商業(yè)價值。目前，孔雀草的組培培養(yǎng)研究比較多，但是鮮有試管開花方面的報(bào)道，其開花機(jī)制研究更少。本研究擬在本試驗(yàn)之前的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)行孔雀草試管苗開花條件的優(yōu)化；同時，克隆與孔雀草試管苗開花相關(guān)的AP1基因，并進(jìn)行AP1基因在藍(lán)白光條件下試管開花的定量PCR表達(dá)分析，以期為孔雀草試管花卉的開發(fā)以及探討試管開花的分子機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

2、　　1、孔雀草試管開花條件的優(yōu)化
　　將孔雀草種子接種于MS培養(yǎng)基中，在幼苗生長35 d左右接種于單因素（TDZ、ZT）、隨機(jī)（白糖和KT、白糖和GA3、NAA和GA3）和四因素三水平的正交（PP333、TDZ、ZT、GA3）中，結(jié)果如下：（1）在TDZ濃度為0.03 mg/L時，可以誘導(dǎo)孔雀草試管開花，開花率為12%；在ZT濃度為1.0 mg/L時，有利于花芽的誘導(dǎo)，并且少量的花芽可以試管開花。（2）在白糖濃度為45 g/L、K

3、T濃度為0.6 mg/L時，有利于花芽的誘導(dǎo)，并在部分處理中發(fā)現(xiàn)有試管開花現(xiàn)象；在白糖濃度為45 g/L、KT濃度為0.8 mg/L時，發(fā)現(xiàn)有2株畸形花蕾；在白糖濃度為45 g/L、GA3濃度為0.4 mg/L，花芽數(shù)最多，并在此處理中發(fā)現(xiàn)，1株植株中有11個花蕾；在NAA濃度為0.05 mg/L、GA3濃度為0.6 mg/L時，花芽數(shù)最多，并在此處理中發(fā)現(xiàn)有試管開花現(xiàn)象。（3）在PP333濃度為0.6 mg/L、TDZ濃度為0.03

4、mg/L、 ZT濃度為1.2 mg/L、GA3濃度為0.5 mg/L時，有利于花芽的形成，并在此處理中發(fā)現(xiàn)有少量的試管開花。同時發(fā)現(xiàn)有1株植株的花芽數(shù)量達(dá)17個。（4）藍(lán)光不利于孔雀草試管開花，并發(fā)現(xiàn)有白化苗現(xiàn)象。
　　2、孔雀草試管苗葉片AP1基因的克隆
　　本文以孔雀草試管苗葉片為材料，成功克隆了孔雀草的 AP1-1及 AP1-2基因的全長cDNA，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。（1） AP1-1基因全長919 bp（Ge

5、nBank登錄號為JX310277），其中5'UTR92 bp、3'UTR149 bp、3'端poly（A）尾巴25 bp，開放閱讀框?yàn)?78 bp，編碼225個氨基酸。AP1-1定位于細(xì)胞核中，為親水蛋白，不含信號肽，共形成4個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；二級結(jié)構(gòu)主要有α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，存在亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和一個MADS-box區(qū)。此蛋白共有7個磷酸化位點(diǎn)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該蛋白與薔薇科植物的AP1蛋白具有較近的親緣關(guān)系。（2）AP1-2

6、基因開放閱讀框?yàn)?55 bp（GenBank登錄號為JX310278），編碼185個氨基酸。AP1-2定位于細(xì)胞質(zhì)中，為親水蛋白，不含信號肽，共形成4個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)；二級結(jié)構(gòu)主要有α螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成，存在亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和一個 K-box區(qū)。此蛋白共有6個磷酸化位點(diǎn)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該蛋白與薔薇科植物的AP1蛋白具有較近的親緣關(guān)系。
　　3、孔雀草試管苗開花過程中AP1基因表達(dá)qPCR分析
　　以18S為內(nèi)參基因，對

7、在藍(lán)、白光條件下不同時期的孔雀草試管苗進(jìn)行AP1基因的熒光定量PCR。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，孔雀草試管苗在藍(lán)白光下AP1基因都有表達(dá)。
　　（1）在藍(lán)光條件下，隨著孔雀草的生長，AP1基因的表達(dá)量逐漸升高，并在壯苗期達(dá)到較高的表達(dá)量。出現(xiàn)花芽時表達(dá)量開始降低，隨著花芽的生長，表達(dá)量逐漸升高，并達(dá)到最高。
　?。?）在白光條件下，孔雀草在幼苗期的表達(dá)量和壯苗期的表達(dá)量都較高。隨著花芽的分化，表達(dá)量開始降低。并隨著花芽的繼續(xù)生長，表達(dá)量又開