梨花柱S-RNase介導(dǎo)自花花粉管死亡特點(diǎn)和路徑研究.pdf

1、以砂梨（Pyrus pyrifolia）品種‘幸水’(S4S5)、‘今村秋’（S1S6）為試材，利用微量花粉管線粒體分離技術(shù)、線粒體膜電位測(cè)定技術(shù)，以及透射電鏡、蛋白免疫印跡、熒光標(biāo)記等方法研究了離體條件下自花授粉后花粉管生長(zhǎng)抑制和死亡的特點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)傳遞，并在活體條件下驗(yàn)證了部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果，主要結(jié)論如下:
　　 1.建立了一套有效的微量花粉管線粒體分離純化技術(shù)。首先利用細(xì)胞篩研磨花粉管，破碎花粉管的同時(shí)過(guò)濾細(xì)胞溶液，避免因研磨過(guò)

2、度導(dǎo)致線粒體被破壞，再綜合前人分離純化線粒體的經(jīng)驗(yàn)，通過(guò)差速離心和密度離心，成功從微量梨花粉管中分離純化出大量線粒體。經(jīng)透射電鏡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，從花粉管分離得到的線粒體純度較高，并且結(jié)構(gòu)完整，同時(shí)具有很好生理活性，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。
　　 2.確定了活體和離體條件下自花授粉花粉管停止生長(zhǎng)的時(shí)間。利用MTT染色法和伊文思藍(lán)染色法分別研究了S-RNase作用下，自花花粉管喪失活力和死亡的時(shí)間，結(jié)果表明在處理30 min后

3、，經(jīng)S-RNase處理的自花花粉管具有活力和正?；ǚ酃芩急嚷拭黠@減少，隨著時(shí)間的推移，這種趨勢(shì)有所加強(qiáng);而用苯胺藍(lán)染色法觀察活體條件下自花授粉后花粉管生長(zhǎng)情況，結(jié)果表明花粉管生長(zhǎng)發(fā)生抑制主要在授粉后9h。這些數(shù)據(jù)為后面研究提供了很好的依據(jù)。
　　 3.確定了自花花粉管死亡具有程序性死亡（programmed cell death，PCD）特點(diǎn)。為了研究梨自花授粉不親和性反應(yīng)中自花授粉花粉管死亡是否屬于PCD，利用熒光標(biāo)記、透射

4、電鏡和蛋白免疫印跡等技術(shù)研究了S-RNase對(duì)自花花粉管線粒體和核DNA的影響，并且研究了類Caspase是否在S-RNase抑制自花花粉管生長(zhǎng)反應(yīng)中被激活。結(jié)果表明，在S-RNase處理30 min后，自花花粉管線粒體膜電位特異性降低，而異花花粉管和對(duì)照卻沒(méi)有明顯變化。此外，在處理120 min，發(fā)現(xiàn)自花花粉管線粒體細(xì)胞色素c泄漏到細(xì)胞質(zhì)，并且線粒體發(fā)生明顯的溶脹現(xiàn)象，電子透射密度降低，脊消失，并伴隨大量空泡出現(xiàn)。更為重要的是，不論是

5、在離體系統(tǒng)中，還是在活體授粉中，自花授粉花粉管核DNA都發(fā)生降解，并且降解順序是先營(yíng)養(yǎng)核，后生殖核。此外，我們的研究結(jié)果表明，在S-RNase抑制自花花粉管死亡的過(guò)程中，并沒(méi)有類Caspase酶被激活。據(jù)此推斷自花授粉花粉管死亡可能屬于PCD，但引起核降解的核酸酶性質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。
　　 4.確定了S-RNase能夠特異性破壞自花花粉管頂端活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)梯度，發(fā)現(xiàn)了一條引起自花

6、授粉花粉管核DNA降解的信號(hào)傳遞路徑。利用熒光標(biāo)記、組織定位和亞細(xì)胞定位等方法，研究了S-RNase對(duì)自花花粉管頂端ROS梯度的影響，以及ROS梯度消失引起花粉管生理代謝變化。結(jié)果表明:S-RNase通過(guò)破壞線粒體結(jié)構(gòu)和降低花粉管NADPH含量，減少ROS在線粒體和細(xì)胞壁上的積累，破壞自花花粉管頂端ROS梯度，最終抑制自花花粉管生長(zhǎng);花粉管頂端活性氧梯度被破壞后，能夠抑制花粉管鈣離子通道開(kāi)放、引起微絲骨架解聚，并最終引起核DNA降解。這