小麥胚乳細(xì)胞程序性死亡機(jī)理初探以及淹水脅迫對(duì)其進(jìn)程的影響.pdf

1、前期研究已經(jīng)證實(shí)小麥胚乳細(xì)胞的發(fā)育是一種特殊的細(xì)胞編程性死亡(programmed cell death, PCD)過(guò)程。環(huán)境脅迫對(duì)胚乳PCD發(fā)生具有重要的影響。其中，濕害作為一種自然災(zāi)害，嚴(yán)重影響小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，關(guān)于小麥胚乳細(xì)胞PCD機(jī)理及淹水脅迫對(duì)小麥胚乳淀粉質(zhì)體和胚乳PCD進(jìn)程的研究比較少。本研究以小麥品種(Triticum aestivumL.)華麥8號(hào)為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)處于開(kāi)花期的小麥進(jìn)行不同時(shí)間梯度的淹水處理，采用四個(gè)處

2、理：不淹水處理(對(duì)照)、淹水3d(3dayswaterlogging treatment, 3DWT,)、淹水7d(7DWT)、淹水12d(12DWT)，然后恢復(fù)正常生長(zhǎng)。從超微結(jié)構(gòu)、TUNEL檢測(cè)、DNA凝膠電泳和基因表達(dá)四個(gè)方面來(lái)探討在發(fā)育后期的正常生長(zhǎng)條件下，小麥胚乳細(xì)胞發(fā)生PCD的機(jī)理。同時(shí)，采用掃描電子顯微術(shù)(Scanning Electron Microscope, SEM)和LUGOL染色對(duì)淹水條件下淀粉粒的發(fā)育狀況進(jìn)行觀

3、察；用透射電子顯微術(shù)(Transmission Electron Microscope,TEM)、Evans-Blue染色法、TUNEL和DNA凝膠電泳檢測(cè)來(lái)研究淹水脅迫對(duì)胚乳細(xì)胞PCD進(jìn)程的影響。主要結(jié)果如下：
　　 1.正常生長(zhǎng)條件下，胚乳細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)顯示花后12d(12dayspostanthesis,12DPA)，細(xì)胞核的雙層核膜出現(xiàn)模糊，隨后染色質(zhì)開(kāi)始凝集，但不發(fā)生典型的趨邊化；細(xì)胞核降解形成核殘?bào)w。25DPA，細(xì)胞

4、核大量降解，在胚乳細(xì)胞中很難找到完整的細(xì)胞核。16DPA，線粒體發(fā)生降解，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生膨脹、環(huán)化。說(shuō)明，細(xì)胞核DNA在25DPA已大量降解。
　　 2.TUNEL檢測(cè)表明12DPA，即可在原位檢測(cè)到核DNA斷裂，隨后陽(yáng)性核數(shù)目增加。16DPA，陽(yáng)性核數(shù)目達(dá)到最大值。
　　 3.正常生長(zhǎng)條件下，胚乳細(xì)胞的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，16DPA,DNA開(kāi)始降解；30DPA，檢測(cè)到典型的DNAladdering條帶。
　　

5、4.RT-PCR結(jié)果表明，AGPase(葡萄糖焦磷酸化酶)的RNA相對(duì)表達(dá)量變化顯著，3DPA,AGPase表達(dá)量較低；9DPA，其表達(dá)量增加；12DPA，表達(dá)量達(dá)到最大值；隨后開(kāi)始下降，21DPA,AGPase僅有少量表達(dá)。
　　 以上結(jié)果說(shuō)明，胚乳細(xì)胞發(fā)生PCD，在細(xì)胞核大量降解之前，與淀粉合成相關(guān)酶基因的RNA已大量合成，從而為后期淀粉的合成提供了物質(zhì)保證。
　　 5.花后小麥旗葉葉綠素含量呈下降趨勢(shì)；淹水處理后，

6、葉綠素含量下降趨勢(shì)更加顯著，且淹水時(shí)間越長(zhǎng)，葉綠素含量越低。淹水造成籽粒體積減小，隨著淹水時(shí)間的延長(zhǎng)，現(xiàn)象越明顯。
　　 6.胚乳細(xì)胞發(fā)育期間，淀粉粒數(shù)目增長(zhǎng)呈S型變化。在發(fā)育早期(8～10DPA),不同處理胚乳細(xì)胞中淀粉粒數(shù)目均在20個(gè)左右。發(fā)育后期(20DPA)淀粉粒的數(shù)目差異明顯，7DWT,12DWT的淀粉粒數(shù)目分別占對(duì)照的82.5％和68％。說(shuō)明淹水造成胚乳細(xì)胞中淀粉粒數(shù)目減少。
　　 7.通過(guò)LUGOL染色和掃

7、描電鏡觀察可知，短期淹水(3DWT)未造成淀粉粒數(shù)目減少；但長(zhǎng)時(shí)間淹水(7DWT,12DWT)導(dǎo)致胚乳細(xì)胞變形嚴(yán)重，B型淀粉粒數(shù)目大量減少，胚乳充實(shí)度差。
　　 8.Evans-Blue染色證實(shí)，淹水加速了胚乳細(xì)胞的死亡，10DWT,10DPA，在胚乳背部即有少量藍(lán)色出現(xiàn)。TUNEL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淹水加劇胚乳細(xì)胞核DNA降解，開(kāi)始降解時(shí)間提前，且隨著淹水時(shí)間延長(zhǎng)，陽(yáng)性核比率升高。不淹水處理的小麥淀粉胚乳在30DPA出現(xiàn)典型的DNAla

8、ddering條帶；而長(zhǎng)時(shí)間淹水處理(12DWT)在20DPA就已經(jīng)出現(xiàn)DNAladdering條帶，說(shuō)明淹水導(dǎo)致小麥胚乳細(xì)胞核DNA大量降解。TEM觀察發(fā)現(xiàn)，不淹水處理的胚乳細(xì)胞核核膜在12DPA出現(xiàn)降解，而3DWT的胚乳在10DPA出現(xiàn)核膜降解；7DWT的胚乳細(xì)胞在8DPA核膜就開(kāi)始降解。不淹水處理的胚乳細(xì)胞在12DPA，線粒體內(nèi)嵴和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)開(kāi)始膨脹；而7DWT的胚乳在10DPA,線粒體就開(kāi)始降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)發(fā)生變形，形成潴泡?？梢?jiàn)淹