microRNA-21對豬骨骼肌生長發(fā)育調(diào)控的研究.pdf

1、在飼養(yǎng)條件一致前提下，豬產(chǎn)肉量的高低和肉品質(zhì)主要取決于肌纖維的數(shù)量和橫截面積，而豬的肌纖維數(shù)量在胚胎期間就已經(jīng)固定，所以胚胎間骨骼肌的生長發(fā)育成為豬產(chǎn)肉數(shù)量和性狀的一個重要因素。而骨骼肌的生長發(fā)育是個很復(fù)雜的生物學(xué)過程，受到多種因素的調(diào)控，研究表明microRNA（miRNA）對其發(fā)揮重要調(diào)控作用。microRNA是一類具有調(diào)控功能的內(nèi)源性非編碼的小分子，其長約18～25個核苷酸，主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，對生物體的生長、發(fā)育、衰老

2、和死亡等生物學(xué)過程都有著重要的作用。本課題組通過高通量測序，發(fā)現(xiàn)miR-21在豬胚胎骨骼肌發(fā)育過程中有差異表達，且在特定階段存在豐富表達。鑒于miR-21在醫(yī)學(xué)疾病中的重要作用意義和本課題的新發(fā)現(xiàn)，我們開展miR-21對豬骨骼肌發(fā)育調(diào)控的研究，旨在為后期豬骨骼肌發(fā)育調(diào)控機理和豬的遺傳育種相關(guān)研究提供參考信息。
　　 microRNA通過調(diào)控靶基因表達而廣泛參與體內(nèi)眾多生理和疾病過程，miR-21調(diào)控骨骼肌的發(fā)育也是同樣的機理。我

3、們運用生物信息學(xué)檢索比較分析，確定候選靶基因TGFBI，設(shè)計引物，合成miR-21 minics，克隆獲得豬TGFBI基因的部分3'UTR，構(gòu)建Psi-Check2-TGFBI3'UTR載體，轉(zhuǎn)染PIEC和PK15細胞，檢測螢光素酶活性。同時利用熒光定量PCR和Western blot等試驗驗-miR-21在RNA和蛋白水平上的變化.結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-21 minics組熒光素酶活性低于對照組，miR-21在RNA水平上抑制TGFBI

4、基因的表達，但差異不顯著（P＞0.05），同時在蛋白水平也發(fā)生了抑制現(xiàn)象，差異顯著(P＜0.05)。
　　 同時利用熒光定量PCR，檢測了miR-21及其候選靶基因TGFBI在通城豬和長白豬中的組織表達譜，以及出生前后骨骼肌發(fā)育中（28個發(fā)育階段）的表達變化，結(jié)果顯示miR-21在通城豬和長白豬中時空表達譜有差異，組織表達分析顯示，miR-21在成年通城母豬的卵巢中表達最豐富，遠遠高于其他組織(P＜0.05)。在成年長白母豬中，

5、miR-21在肝臟組織中表達顯著高于其他組織（P＜0.05），其他組織中分布相對平衡，沒有發(fā)現(xiàn)特異性表達組織;通城豬與長白豬相比較發(fā)現(xiàn)，miR-21在通城豬和長白豬同一個組織表達存在差異。在心、肝、肺、腎、小腸、子宮和背最長肌中長白豬miR-21的表達量顯著高于通城豬（P＜0.05），其他組織（脾、卵巢）差異不顯著。時期表達譜分析發(fā)現(xiàn)，miR-21在脂肪型通城豬和瘦肉型長白豬骨骼肌生長發(fā)育過程中表達模式存在明顯差異，通城豬從胚胎期33

6、d到成年，miR-21都有不同程度的表達，在胚胎期90d達到峰值。長白豬中，出生前的E33 d幾乎檢測不到表達而胚胎期105 d是最高表達豐度，其他階段之間miR-21表達變化不大，成年背最長肌中相對較低。miR-21的表達在胚胎期55 d，80 d、90 d和95 d，通城豬和長白豬存在顯著差異。在mRNA水平，候選靶基因TGFBI在成年通城豬和長白豬組織表達譜相對一致，TGFBI在脾臟中含量最豐富，顯著高于其他組織(P＜0.05)，

7、其次肺中也有較高的表達，成年背最長肌中TGFBI水平最低，心肌中表達也很低。其他組織（肝、小腸、子宮和腎）也檢測到TGFBI有較低的表達。通城和長白豬整個發(fā)育期的骨骼肌中基本都檢測出TGFBI的表達。胚胎期33 d至胚胎期50 d表達量成上升趨勢，胚胎期50 d達到峰值，隨著骨骼肌的發(fā)育，TGFBI含量也逐漸減少，成年骨骼肌中幾乎檢測不到TGFBI的存在。胚胎期55d、100d和出生后9d、180 d和成年豬中，TGFBI表達存在顯著差