煙粉虱吡蟲啉抗性的監(jiān)測(cè)與機(jī)理.pdf

1、煙粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，主要分布于熱帶以及亞熱帶地區(qū)，其寄主植物超過600余種，曾被冠以“超級(jí)害蟲”的稱號(hào)。煙粉虱不僅可以直接對(duì)寄主植物造成危害，而且可以傳播多種植物病毒，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。煙粉虱是一個(gè)處于快速進(jìn)化中的復(fù)合種群，存在許多生物型，各個(gè)生物型之間存在生殖隔離，在形態(tài)上難以區(qū)分，而在生活習(xí)性，適合度，傳毒能力以及抗藥性等方面存在一定的差別。目前報(bào)道的煙粉虱生物型

2、超過27種，其中B型和Q型是為害最嚴(yán)重、呈全球性分布的生物型，而其他生物型為局部分布。B型煙粉虱先于Q型煙粉虱入侵我國(guó)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)，但近年來Q型已逐漸取代B型。
　　 吡蟲啉是新煙堿類殺蟲劑的代表藥劑，自從1991年商品化以來，被用于防治多種作物上的害蟲，由于其良好的內(nèi)吸活性，尤其對(duì)刺吸式害蟲效果顯著。吡蟲啉是一種神經(jīng)毒劑，作用于昆蟲的煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)。由于其具備良好的選擇毒力，對(duì)昆蟲高毒而對(duì)哺乳動(dòng)物低毒，所以被

3、廣泛使用。隨著各類殺蟲劑的不合理施用，煙粉虱逐漸對(duì)多種殺蟲劑如有機(jī)磷、有機(jī)氯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯以及昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等產(chǎn)生了不同程度的抗性。在煙粉虱的防治過程中，由于吡蟲啉良好的防效，使得其施用過于頻繁，早在1998年西班牙南部Q型煙粉虱就對(duì)其產(chǎn)生了抗性。
　　 本文對(duì)我國(guó)煙粉虱生物型和抗藥性水平進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，對(duì)B型煙粉虱對(duì)吡蟲啉抗性遺傳方式、交互抗性及抗性生化機(jī)理進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)成功篩選

4、出與煙粉虱吡蟲啉抗性相關(guān)的2個(gè)細(xì)胞色素P450基因。本文的研究結(jié)果明確了我國(guó)田間煙粉虱的抗性和生物型的發(fā)展?fàn)顩r，并為煙粉虱對(duì)新煙堿類殺蟲劑抗性的治理提供重要理論依據(jù)。
　　 一、煙粉虱生物型及抗藥性的監(jiān)測(cè)
　　 對(duì)我國(guó)東南沿海地區(qū)7個(gè)省以及新疆維吾爾自治區(qū)在內(nèi)的14個(gè)點(diǎn)煙粉虱的生物型及抗藥性進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。在這14個(gè)點(diǎn)中共檢測(cè)到兩種煙粉虱生物型(B型和Q型)，9個(gè)點(diǎn)為Q型煙粉虱，3個(gè)點(diǎn)為B型，2個(gè)點(diǎn)為B型和Q型共存。在所監(jiān)測(cè)

5、的地區(qū)，兩種生物型的所有煙粉虱已經(jīng)對(duì)吡蟲啉(Imidacloprid)和噻蟲嗪(Thiamethoxam)產(chǎn)生了中到高水平的抗性(與敏感種群比較，吡蟲啉28至1900倍，噻蟲嗪29倍至1200倍)；對(duì)α-氯氰菊酯(alpha-cypermethrin)產(chǎn)生了中到高水平的抗性(22-610倍)；只有部分種群對(duì)氟蟲腈(Fipronil)產(chǎn)生了低到中等抗性(10-25倍)；對(duì)多殺菌素(Spinosad)產(chǎn)生了低水平的抗性(5.7-6.4倍)；

6、所有調(diào)查種群對(duì)阿維菌素均保持敏感。在我國(guó)東南沿海地區(qū)，Q型煙粉虱正在逐漸取代B型煙粉虱而成為優(yōu)勢(shì)種群；我國(guó)煙粉虱種群已經(jīng)對(duì)新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉和噻蟲嗪產(chǎn)生中高水平抗性，需要限制使用；我國(guó)煙粉虱尚未對(duì)阿維菌素產(chǎn)生抗性，可以與其他藥劑輪換使用，以延緩煙粉虱抗藥性的發(fā)展。
　　 二、B型和Q型煙粉虱種群競(jìng)爭(zhēng)與抗藥性的關(guān)系
　　 在室內(nèi)用棉花植株飼養(yǎng)情況下，對(duì)采自浙江杭州的煙粉虱B型和Q型混合種群的生物型組成以及抗藥性水平進(jìn)行了

7、多代的監(jiān)測(cè)。在室內(nèi)飼養(yǎng)的F0代，兩種生物型個(gè)體比例相當(dāng)；在F10代，Q型已經(jīng)完全被B型所取代。與F0代相比，F(xiàn)10代煙粉虱種群對(duì)吡蟲啉、阿維菌素和氟蟲腈的抗性水平明顯下降，而對(duì)α-氯氰菊酯的抗性保持穩(wěn)定。該研究表明：在沒有殺蟲劑選擇壓力的室內(nèi)條件下，B型煙粉虱比Q型更具生存優(yōu)勢(shì)。然而在新煙堿類殺蟲劑廣泛使用的田間條件下，煙粉虱Q型因比B型對(duì)新煙堿類殺蟲劑具有更強(qiáng)的抗性而獲得競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。
　　 三、B型煙粉虱抗吡蟲啉品系的篩選、交互

8、抗性以及抗性遺傳方式
　　 利用成蟲浸葉法進(jìn)行了連續(xù)30代篩選，培育了1個(gè)B型煙粉虱抗吡蟲啉品系NJ-Imi，其與對(duì)照品系NJ相比有490倍的抗性。研究發(fā)現(xiàn)，NJ-Imi品系對(duì)其他3種新煙堿類殺蟲劑啶蟲脒(Acetamiprid)，噻蟲嗪和烯啶蟲胺(Nitenpyram)存在高水平的交互抗性；與殺蟲單(monosultap)，巴丹(cartap)以及多殺菌素存在低水平交互抗性；與阿維菌素?zé)o交互抗性。B型煙粉虱對(duì)吡蟲啉的抗性為常染

9、色體控制的半顯性遺傳。
　　 四、B型煙粉虱抗吡蟲啉品系的抗性生化機(jī)理
　　 以B型煙粉虱抗吡蟲啉品系(NJ-Imi)和敏感品系(NJ)為試蟲，通過增效劑生物測(cè)定和解毒代謝酶活力分析，研究了B型煙粉虱吡蟲啉抗性的生化機(jī)理。分別在篩選過程中的地15代(G15)和第30代(G30)測(cè)定了PBO，DEM和DEF對(duì)吡蟲啉的增效作用。在抗性品系中，多功能氧化酶抑制劑PBO在G15和G30分別對(duì)吡蟲啉有2.5倍和2.1倍的增效作用，

10、而在敏感品系中沒有增效作用；抗性品系細(xì)胞色素P450單加氧酶活力為敏感品系的2.5倍；在抗性和敏感品系中，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶抑制劑DEM對(duì)吡蟲啉都沒有增效作用，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的活力在兩品系間也沒有顯著差異；在G15時(shí)，在抗性和敏感品系中，酯酶抑制劑DEF對(duì)吡蟲啉有2.7倍和2.5倍的增效作用，而在G30時(shí)DEF對(duì)吡蟲啉沒有明顯的增效作用；酯酶活力在抗性品系中比敏感品系中有所降低；這表明在抗性品系中，多功能氧化酶活力的提高可能參與了吡

11、蟲啉抗性的形成。
　　 五、B型煙粉虱抗吡蟲啉品系轉(zhuǎn)錄組的測(cè)定以及數(shù)據(jù)的分析
　　 利用Illumina(Solexa)測(cè)序平臺(tái)，結(jié)合RNA-Seq技術(shù)，對(duì)B型煙粉虱抗吡蟲啉品系成蟲轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序。經(jīng)測(cè)序得到3700萬個(gè)reads，經(jīng)聚類分析后得到7萬個(gè)unigenes(平均長(zhǎng)度619bp)。基于NCBI以及其他生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，對(duì)組裝獲得的unigenes做了Contig長(zhǎng)度分布，Scaffold-gene長(zhǎng)度分布，

12、Scaffold-gene功能注釋，Scaffold-gene的GO分類，蛋白功能和分類預(yù)測(cè)以及Scaffold-gene代謝通路分析。同時(shí)，還分析了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中抗藥性相關(guān)的基因，包括細(xì)胞色素P450基因，酯酶基因(EST)，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因(GST)以及煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)。煙粉虱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)將為煙粉虱抗藥性機(jī)理研究工作奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 六、與吡蟲啉抗性相關(guān)的煙粉虱細(xì)胞色素P450基因篩選
　

13、　 從B型煙粉虱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出編碼細(xì)胞色素P450的序列141條(長(zhǎng)度從100bp到2000bp以上)，去掉其中較短的序列以及重復(fù)測(cè)序的序列，共得到37條編碼P450基因的序列，將這些序列與NCBI的nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，并根據(jù)細(xì)胞色素P450基因的命名規(guī)則進(jìn)行命名，其中有2個(gè)序列已命名(CYP6CX1V1和CYP6CM1)，其余35個(gè)細(xì)胞色素P450基因均為新命名的P450基因。通過傳統(tǒng)Sanger測(cè)序法對(duì)這些序列進(jìn)行了克隆和測(cè)序

14、驗(yàn)證。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較了這37個(gè)P450基因mRNA在NJ-Imi抗性品系(B型)、China-YN抗性品系(Q型)和SUD-S敏感品系(非B/Q)中的表達(dá)水平。結(jié)果表明：CYP6CX4和CYP6CM1在2個(gè)抗性品系中具有10-35倍的過量表達(dá)；3個(gè)P450基因(CYP6CX2，CYP6CX3，和CYP6DZ4)在2個(gè)抗性品系具有1.9-6.7倍的過量表達(dá)；5個(gè)P450基因(CYP4C64，CYP4G69，CYP6DW2，CY

15、P6DW3和CYP6CX5)的mRNA表達(dá)量在3個(gè)品系中相近。為了明確CYP6CX4和CYP6CM1基因過量表達(dá)與抗藥性的關(guān)系，分別用區(qū)分劑量處理了China-XJ田間品系(B型)和China-NJ田間品系(Q型)煙粉虱成蟲，這2個(gè)P450基因在吡蟲啉處理存活成蟲中mRNA表達(dá)量均明顯高于未處理成蟲，表明這2個(gè)P450基因過量表達(dá)與吡蟲啉抗性有關(guān)。已有研究報(bào)道了CYP6CM1過量表達(dá)與吡蟲啉抗性有關(guān)，CYP6CX4與吡蟲啉抗性相關(guān)為本研