棉蚜對吡蟲啉靶標抗性分子檢測技術研究.pdf

1、棉蚜Aphisgossypii Glover(Hemiptera∶ Aphididae)是一種重要的世界性農業(yè)害蟲，是為害棉花的主要害蟲之一，在中國各個棉區(qū)都有發(fā)生。作用于昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinicacetylcholine receptor，nAChR)的新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉廣泛用于棉蚜的防治。但是隨著吡蟲啉使用范圍的擴大和使用頻率的增加，棉蚜對吡蟲啉的抗性在全世界都有報道。研究表明抗吡蟲啉棉蚜煙堿型乙酰膽堿受體β1亞

2、基發(fā)生精氨酸向蘇氨酸的突變(R81T)。在此基礎上，本文建立競爭性等位特異性PCR技術(cPASA)和實時熒光定量等位特異性PCR技術(rtPASA)檢測棉蚜nAChRβ1亞基R81T的突變頻率，從而明確田間棉蚜種群對吡蟲啉的抗性水平。
　　1.吡蟲啉對棉蚜田間種群毒力測定
　　采用浸葉法，測定了山東德州(DZ)、北京(BJ)，河南許昌(XC)、河北邯鄲(HD)和廊坊(LF)五個地區(qū)棉蚜種群對吡蟲啉的敏感性。結果表明，五個地

3、區(qū)的棉蚜種群對吡蟲啉敏感度不同。河南許昌(XC)和北京種群(BJ)對吡蟲啉較為敏感，LC50值分別為1.03μg/mL和0.87μg/mL。河北邯鄲(HD)棉蚜種群對吡蟲啉也處于較敏感階段，其LC50值為3.74μg/mL;河北廊坊種群(LF)和山東德州種群(DZ)對吡蟲啉均有一定的抗性，LC50值分別為20.70μg/mL和44.90μg/mL。將北京種群(BJ)作為敏感種群，河北邯鄲(HD)棉蚜種群的相對抗性倍數(shù)為4.3倍，未達到抗

4、性水平;廊坊種群(LF)和山東德州種群(DZ)的相對抗性倍數(shù)分別為23.8倍和51.6倍，處于中高抗水平。
　　2.棉蚜抗、感種群煙堿型乙酰膽堿受體α1亞基基因克隆
　　以棉蚜的BJ敏感種群和DZ、LF抗性種群為實驗材料，對煙堿型乙酰膽堿受體α1亞基基因片段進行克隆，并進行序列分析。結果發(fā)現(xiàn)，DZ、LF棉蚜抗性種群存在與吡蟲啉抗性相關的精氨酸到蘇氨酸(R81T)突變， BJ敏感種群不存在R81T的突變。
　　3.競爭性

5、等位特異性PCR技術檢測棉蚜田間種群對吡蟲啉抗性
　　根據棉蚜R81T突變位點，設計了cPASA檢測引物，檢測LF、DZ棉蚜田間種群R81T突變頻率。結果表明，田間LF種群R81T突變頻率為38％，DZ種群R81T突變頻率為48％。
　　4.實時熒光定量等位特異性PCR技術建立
　　為了建立一種更加快速、精確的檢測方法，將等位特異性PCR技術與實時熒光定量PCR方法相結合，建立了實時熒光定量等位特異性PCR(rtPAS

6、A)方法。將突變純合子(RR)與敏感純合子(SS)以不同比例混合，利用熒光定量PCR技術得到突變頻率與Ct值之間的標準曲線，當突變頻率＞1％時，標準曲線為y=-3.613x+20.37，R2=0.991;當突變頻率＜1％時，標準曲線為y=18.8+2.1/{1+10-(0.7x+035)}，R2=0.997。通過測定樣品的Ct值得到田間抗性種群的突變頻率。
　　5.實時熒光定量等位特異性PCR技術檢測棉蚜田間種群對吡蟲啉抗性

7、>　　根據已經建立的方法，測定棉蚜田間抗性種群R81T突變頻率。結果表明，LF種群R81T突變頻率為34.7％±1.3％，其95％置信區(qū)間為31.4-38.1％;DZ種群R81T突變頻率為45.2％±5.2％，其95％置信區(qū)間為32.3-58.1％。該方法測得的棉蚜種群R81T突變頻率與cPASA檢測到的頻率結果相匹配(LF38％，DZ48％)，說明rtPASA方法可以檢測與吡蟲啉抗性有關的靶標位點突變，以實現(xiàn)快速、有效地監(jiān)測棉蚜田間抗