小麥TaMYB3R1抗逆功能與轉(zhuǎn)Hpal10-42小麥對(duì)赤霉病和蚜蟲抗性的初步研究.pdf

1、植物對(duì)防衛(wèi)反應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控是抗病抗蟲的重要機(jī)制，可以由病原物侵染和害蟲侵襲以及生物與非生物激發(fā)子處理來誘發(fā)。用來自水稻白葉枯病菌的蛋白質(zhì)激發(fā)子Hpa1Xoo處理擬南芥，可以誘發(fā)AtMYB44的活性;AtMYB44通過調(diào)控乙烯信號(hào)通路而參與植物抗蟲的能力;通過表觀遺傳和基于水楊酸信號(hào)通路的交叉互作，來調(diào)節(jié)抗病性。鑒于轉(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)抗病蟲作用以及在小麥上的有關(guān)研究還剛剛起步、有很大的挖掘潛力這一現(xiàn)狀，本研究基于ESTs數(shù)據(jù)庫，對(duì)小麥的MYB家族基因

2、進(jìn)行了生物信息學(xué)鑒定。同時(shí)，對(duì)其中的一個(gè)受ABA誘導(dǎo)的MYB3R轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了克隆與功能研究，確定了其在非生物脅迫中的作用。另外，以Hpa1Xoo的一個(gè)功能片段為目的基因構(gòu)建了小麥轉(zhuǎn)基因載體，通過基因槍的方法導(dǎo)入揚(yáng)麥16號(hào)品種，經(jīng)過篩選及PCR實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了目的基因已整合進(jìn)小麥基因組，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥的抗病性進(jìn)行了初步測定。
　　 1.基于ESTs數(shù)據(jù)庫的小麥MYB家族基因鑒定
　　 MYB蛋白是高等植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因

3、子家族，參與了植物生長發(fā)育過程中的多種代謝途徑。在擬南芥和水稻中，已經(jīng)對(duì)MYB蛋白進(jìn)行了全基因組水平的系統(tǒng)鑒定和研究。小麥由于沒有完整的基因組信息，關(guān)于這類轉(zhuǎn)錄因子的研究較少。本研究中，利用擬南芥和水稻MYB蛋白的信息，結(jié)合生物信息學(xué)手段，從小麥ESTs數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行了MYB基因的發(fā)掘和鑒定。結(jié)果共鑒定到含有MYB結(jié)構(gòu)域的218條序列，包含了MYB家族的MYB1R、R2R3MYB、MYB3R以及MYB4R成員。通過電子延伸和ORF查找的方

4、法對(duì)R2R3MYB基因進(jìn)行了全長ORF的搜尋，共得到36條具有完整ORF的cDNA序列。為了初步了解這些MYB蛋白的生物學(xué)功能，我們利用小麥、擬南芥及水稻中MYB蛋白序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育樹分析，對(duì)小麥中的MYB蛋白進(jìn)行了功能聚類;同時(shí)對(duì)擬南芥和水稻中的同源基因進(jìn)行了查找。小麥中的MYB基因與擬南芥中的同源基因有相似的根、莖、葉和花組織特異性表達(dá)模式。基于MEME服務(wù)器，我們對(duì)小麥、擬南芥及水稻中的R2R3MYB蛋白進(jìn)行了功能域的搜尋，預(yù)測

5、到8個(gè)功能域，并進(jìn)一步分析了這些功能域在小麥MYB蛋白中的分布模式。
　　 2.小麥TaMYB3R1的克隆與功能研究
　　 干旱、低溫和鹽脅迫是限制農(nóng)作物生長和產(chǎn)量的重要環(huán)境因素。發(fā)掘和鑒定植物中參與這些脅迫過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，不僅有利于闡明植物應(yīng)對(duì)這些脅迫的機(jī)制，而且還能為基因工程改良農(nóng)作物提供優(yōu)秀的基因資源，達(dá)到增產(chǎn)的目的。在本研究中，根據(jù)第一章的鑒定結(jié)果，我們選取了一個(gè)受ABA誘導(dǎo)的MYB3R片段做為研究對(duì)象，采用

6、RT-PCR和RACE策略成功獲得了該基因的全長，命名為TaMYB3R1。多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)TaMYB3R1同其他的植物和動(dòng)物MYB3R蛋白具有保守的R1、R2和R3重復(fù)序列。進(jìn)一步的進(jìn)化樹分析顯示TaMYB3R1屬于植物MYB3R蛋白，并且同R2R3MYB蛋白相比，與植物的MYB3R蛋白和動(dòng)物MYB蛋白具有更高的同源性，可以歸為一個(gè)分支，這也顯示MYB3R蛋白在植物和動(dòng)物進(jìn)化過程中的保守功能。洋蔥表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)證明該蛋白定位于

7、細(xì)胞核。酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活活性分析顯示該轉(zhuǎn)錄因子能激活lacZ報(bào)告基因的表達(dá)，并且C端(221-605)具有轉(zhuǎn)錄激活作用，而N端(1-220)不具有這種轉(zhuǎn)錄激活作用。實(shí)時(shí)熒光定量分析顯示該基因受激素ABA和JA以及干旱、低溫和高鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。另外，擬南芥過表達(dá)TaMYB3R1的植株表現(xiàn)出對(duì)干旱及鹽脅迫的耐受性，且TaMYB3R1同時(shí)影響了依賴ABA和不依賴ABA兩條信號(hào)通路基因的表達(dá)，表明TaMYB3R1參與擬南芥不同的滲透脅迫響應(yīng)過程

8、。
　　 3.轉(zhuǎn)pUbi::Hpa110-42小麥的產(chǎn)生及其對(duì)赤霉病和蚜蟲抗性的初步測定
　　 麥蚜和赤霉病是世界范圍內(nèi)小麥上的頑蟲、頑病，嚴(yán)重影響小麥產(chǎn)量和品質(zhì)。傳統(tǒng)的遺傳育種方法由于有限的抗源，往往不能得到理想的抗性品種。而植物基因工程技術(shù)的出現(xiàn)，使得我們能夠在更廣闊的范圍內(nèi)尋找優(yōu)秀的抗源，并整合植物產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)和抗病蟲的品種。我們前期研究表明，激發(fā)子harpins能啟動(dòng)植物不同的生長與防衛(wèi)信號(hào)通路，進(jìn)而在植物上引

9、起多種有益的表型，包括促進(jìn)植物生長、抗旱以及抗病蟲等。本研究采用實(shí)驗(yàn)室前期已進(jìn)行深入研究的Hpa110-42為目的基因，選用單子葉植物中高效表達(dá)的Ubi啟動(dòng)子構(gòu)建小麥轉(zhuǎn)化載體，采用基因槍的方法將pUbi::Hpa110-42轉(zhuǎn)入揚(yáng)麥16號(hào)品種，并經(jīng)過篩選和溫室內(nèi)繁育得到了T1代植株。對(duì)T1代植株進(jìn)行了生長性狀（包括株高和分蘗）的調(diào)查以及病蟲害的抗性測定。赤霉病抗性鑒定結(jié)果初步表明溫室內(nèi)的轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)為發(fā)病程度輕、擴(kuò)展慢。對(duì)蚜蟲抗性效果