害蟲生防真菌多藥抗性與侵染褐飛虱的高毒力菌株篩選篩略研究.pdf

1、昆蟲病原真菌是害蟲微生物防治的重要資源，其制劑被廣泛用于農(nóng)林害蟲防治。生防菌劑的殺蟲效果不僅僅取決于生產(chǎn)菌株的遺傳特性，更受到各種環(huán)境脅迫因素的影響，用于植物病害防治的各類真菌殺菌劑的存在是影響生防菌劑在田間應(yīng)用效果的重要脅迫因素之一。因此，探索生防真菌對藥物脅迫的內(nèi)在保護(hù)機(jī)制，通過遺傳改良提高生產(chǎn)菌株的抗藥性，對于提高生防菌劑的田間效果和穩(wěn)定性具有重要意義。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporte

2、r proteins)是很多生物體內(nèi)存在的的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是保護(hù)細(xì)胞免受殺菌劑傷害的重要作用機(jī)制之一。但是，這一重要的抗藥機(jī)制在昆蟲病原真菌中的研究報道仍處于空白狀態(tài)。
　　 本研究以生防真菌過寄主對后分生孢子表面理化特征的變化與毒力的相關(guān)性研究為起點(diǎn)，重點(diǎn)研究生防真菌對多菌靈的抗性機(jī)制。利用基因差異表達(dá)譜，分析了球孢白僵菌中可能存在多菌靈抗性相關(guān)的其它機(jī)制，由此提出新發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因在生防真菌多藥抗藥性中可能起重要作用的

3、假設(shè)。在此基礎(chǔ)上，以球孢白僵菌作為研究對象對已知的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了實(shí)時定量PCR分析，獲得了一些作用比較明顯的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及上游的控制元件。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行相關(guān)基因的敲除及表型分析，較好地證明了上述假設(shè)。利用化學(xué)誘變的方法，通過對玫煙棒束孢Isaria fumosorosea(同物異名為玫煙色擬青霉 Paecilomyces fumosoroseus)的多菌靈抗性菌株的基因突變位點(diǎn)和基因表達(dá)的分析，發(fā)現(xiàn)在棒束孢抗性菌株產(chǎn)生了多藥抗藥性

4、，這不同于球孢白僵菌(Beauveria bassiana)對多菌靈的抗性主要基于β-微管蛋白的關(guān)鍵點(diǎn)位突變，進(jìn)一步證明了多藥抗藥性機(jī)制在生防真菌中存在的普遍性，論文主要內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 球孢白僵菌過寄主改變孢子表面性狀并提高對褐飛虱的毒力褐飛虱是主要水稻害蟲，嚴(yán)重威脅水稻生產(chǎn)。在用不同寄主和地理來源的21株球孢白僵菌對褐飛虱三齡若蟲進(jìn)行高濃度的生物測定中，若蟲死亡率僅有2％～23％。將各菌株連續(xù)過寄主后進(jìn)行同樣的生物測定

5、，其中的三個菌株過寄主二次后，對三齡若蟲的致死率提高到50％以上，再過寄主則不再提高侵染力；而其余菌株過寄主后侵染力無明顯變化。通過對歷次過寄主后菌株分生孢子表面疏水力(Hr)、zeta電位(Pz)和蛋白酶Pr1活力(Ap)的測定結(jié)果，顯示在三株菌中這些性狀的變化與過寄主的次數(shù)(N)相關(guān)。多變量線性相關(guān)分析顯示，N、Hr和Pz對毒力升高的貢獻(xiàn)率達(dá)89％。顯著的線性相關(guān)還分別包括Hr與N(r2=0.64)、Pz與N(r2=0.52)、Ap

6、與N(r2=0.51)、Hr與Ap(r2=0.45)及Pz與Ap(r2=0.57)之間。這些結(jié)果說明，Hr、Pz等分生孢子表面理化特性的改變，關(guān)系到菌株對異源寄主體壁附著的適應(yīng)性，因而可作為生防菌株篩選的可測性理化指標(biāo)。
　　 球孢白僵菌抗多菌靈菌株的基因表達(dá)譜分析對野生株Bb2860和多菌靈高抗的兩株球孢白僵菌(2860-M2-6和2860-M2-11)在含和不含MBC200μg/mL的SDAY平板菌落中的基因表達(dá)進(jìn)行兩兩比較

7、的差異分析，最終兩組數(shù)據(jù)的交集獲得了144個與多菌靈抗性相關(guān)的上調(diào)基因。將基因利用R統(tǒng)計(jì)學(xué)語言進(jìn)行聚類分析，并根據(jù)其代謝途徑和功能將這144個基因分為五大類，從中挑選了5個轉(zhuǎn)錄因子、5個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶和2個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，用實(shí)時定量PCR檢測12個基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，證明表達(dá)譜數(shù)據(jù)的可靠性，即它們的高表達(dá)與多菌靈抗性密切相關(guān)，顯示球孢白僵菌可能存在多樣的多菌靈抗性機(jī)制。其中，新發(fā)現(xiàn)的兩個藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能在多菌靈抗性中扮演重要角色，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)

8、中對其進(jìn)行更深入的分析。
　　 球孢白僵菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的功能分析從球孢白僵菌基因組中找到12個藥物轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的基因序列，分屬于三個家族：多向抗藥性(PDR)基因6個、多藥抗藥性(MDR)基因5個和多藥抗藥性關(guān)聯(lián)(MRP)基因1個。在MBC、嘧菌酯(ASB)和草丁膦(PPT)三種藥物不同時間的誘導(dǎo)條件下，用實(shí)時定量PCR方法測定各基因的轉(zhuǎn)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)2個PDR基因和1個MDR基因的表達(dá)量上調(diào)顯著。將此3個基因(BbABC1、B

9、bABC2及BbMDR1)與差異表達(dá)譜中獲得的2個轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(BbABC5、BbMRP)進(jìn)行單基因敲除和表型分析，結(jié)果顯示，敲除株△BbABC1、△BbABC2、△BbABC5、△BbMDR1和ABMRP對9種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的化學(xué)藥物(殺菌劑8種和剛果紅)的敏感度差異很大，多表現(xiàn)為抗藥性下調(diào)，也存在抗藥性不變或上調(diào)的表型。五個敲除株對雙氧水和甲萘醌誘導(dǎo)的氧化脅迫的耐受力都表現(xiàn)為下調(diào)趨勢，但下調(diào)程度不同。△BbABC1、△BbABC2和△B

10、bMDR1對斜紋夜蛾二齡幼蟲的毒力測定顯示，△BbABC1和△BbMDR1毒力顯著下降而△BbABC1無顯著下降，說明BbABC1和BbMDR1是可能的毒力相關(guān)因子。由此證明，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)量在很大程度上決定球孢白僵菌的抗藥性，有的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白還影響毒力。
　　 球孢白僵菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)控因子Bbgal的克隆與分析比較在真核細(xì)胞中存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控激活元件(PXR或Galllp)，這樣的小分子蛋白可與異源藥物結(jié)合上調(diào)多種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表

11、達(dá)。通過基因比對分析，在白僵菌基因組中獲得一個與已知Galllp蛋白基因類似的基因(Bbgal)。根據(jù)實(shí)時定量PCR測定，在MBC、ASB和PPT藥物誘導(dǎo)條件下該基因在球孢白僵菌中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平均上調(diào)。將該基因敲除后進(jìn)行表型分析，證明Bbgal的功能與酵母Galll基因的功能相似。敲除株△Bbgal對10種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)(殺菌劑9種和剛果紅)的抗性，大多表現(xiàn)為顯著下調(diào)，唯一例外是對ASB的抗性不變。該敲除株菌落生長對雙氧水和甲萘醌

12、氧化脅迫響應(yīng)的方向相反，分別為顯著上調(diào)和下調(diào)；對斜紋夜蛾二齡幼蟲的毒力較野生株顯著下降。由此暗示，作為轉(zhuǎn)錄激活因子的Bbgal，可能通過與進(jìn)入細(xì)胞的異源物質(zhì)(藥物)結(jié)合而調(diào)控球孢白僵菌中藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，從而影響該菌的抗藥性和毒力。
　　 玫煙棒束孢多菌靈抗性菌株的誘變及相關(guān)基因分析為了探討棒束孢對多菌靈(二甲基苯丙咪唑氨基甲酸，MBC)抗性的可能機(jī)制，將一個對多菌靈敏感的野生菌株If116(MBC EC50:1.67μg/m

13、L)在含有多菌靈的平板上進(jìn)行化學(xué)誘突，獲得9個抗藥性巨幅提高(MBC EC50:99.4至1000μg/mL以上)但耐高溫脅迫能力顯著降低的突變株。遺傳連鎖分析表明，所有抗性菌株的α-和β-微管蛋白基因不存在已知的多菌靈抗性增強(qiáng)的點(diǎn)突變。根據(jù)羅丹明熒光染料色和細(xì)胞流式測定，發(fā)現(xiàn)多菌靈與羅丹明在If116細(xì)胞的排出中存在競爭抑制，顯示染料泵出可能涉及多向抗藥性pleiotropic drugresistance(PDR)有關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋

14、白。為了進(jìn)一步闡明高抗多菌靈突變株中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的可能作用，從野生株和9個突變株中克隆出了同一編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因ifT1及其上游序列。通過基因序列比對分析，發(fā)現(xiàn)所有突變株ifT1基因編碼區(qū)不存在任何點(diǎn)突變，但其上游啟動子區(qū)均有3個轉(zhuǎn)錄因子的重要結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了相同的點(diǎn)突變，即-2202G→A、-836C→T和-300C→T。實(shí)時定量PCR分析表明，野生株 ifT1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平隨多菌靈濃度增加而被誘導(dǎo)性提高，而9個突變株中的ifT