水稻白葉枯病菌和條斑病菌對(duì)噻枯唑和鏈霉素的抗藥性機(jī)理研究.pdf

1、水稻白葉枯病和水稻條斑病是水稻上的兩種重要細(xì)菌性病害，噻枯唑和鏈霉素則是我國(guó)防治這兩種病害的主要藥劑。噻枯唑和鏈霉素在我國(guó)使用分別已有30年和50年的歷史，在靶標(biāo)病原群體中也均已出現(xiàn)抗藥性。因此開(kāi)展噻枯唑和鏈霉素抗性機(jī)理研究，對(duì)于抗藥性治理和抗性診斷技術(shù)發(fā)展具有十分重要的意義。本論文圍繞抗性機(jī)理進(jìn)行了以下研究：1.水稻白葉枯病菌抗噻枯唑菌株粘?；蚪M文庫(kù)構(gòu)建；2.抗噻枯唑水稻白葉枯菌株基因組文庫(kù)的活體篩選和基因分析；3.水稻條斑病菌和白

2、葉枯病菌抗鏈霉素分子機(jī)理研究；4.水稻白葉枯病菌、條斑病菌、大白菜軟腐病菌以及柑橘潰瘍病菌抗藥基因rpsL的分子檢測(cè)。
　　 1.水稻白葉枯病菌噻枯唑抗性菌株粘粒基因組文庫(kù)構(gòu)建
　　 為了探索水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)對(duì)噻枯唑的抗性機(jī)制，本研究建立了白葉枯病菌噻枯唑抗性菌株2-1-1的粘粒基因組文庫(kù)。通過(guò)對(duì)2-1-1基因組提取并不完全酶切，回收>23.13kb基因片段

3、，用來(lái)自溶源菌BHB2688和BHB2690、效價(jià)達(dá)1×108pfu/μgDNA的包裝蛋白包裝，感染宿主大腸桿菌S17-1，在含LB+Km+Sp的平板上進(jìn)行篩選，隨機(jī)挑選1200個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴(kuò)增保存，庫(kù)容達(dá)到2.7倍；隨機(jī)挑選15個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗(yàn)證，均有外源片段插入粘粒載體中，插入片段大小23-40kb，成功構(gòu)建了抗噻枯唑白葉枯病菌2-1-1的粘粒基因組文庫(kù)。
　　 2.水稻白葉枯菌噻枯唑抗性菌株基因組文庫(kù)的活體篩選和基因分析

4、
　　 將構(gòu)建好的白葉枯病菌噻枯唑抗性菌株2-1-1粘?；蚪M文庫(kù)，1200個(gè)轉(zhuǎn)化子通過(guò)兩親交配轉(zhuǎn)染白葉枯病菌野生敏感菌株P(guān)XO99，獲得的結(jié)合子再剪葉接種經(jīng)300μg/ml噻枯唑處理的稻苗，篩選發(fā)現(xiàn)646、518等2個(gè)結(jié)合子表現(xiàn)抗藥性；同時(shí)通過(guò)在清水對(duì)照處理的水稻上篩選，發(fā)現(xiàn)5、33、115、152、119、102、172、519、537、611、643、501、694、518、612、654、308、919、670等多個(gè)轉(zhuǎn)化

5、子在致病性上強(qiáng)于2-1-1和PXO99。通過(guò)對(duì)646和518片段進(jìn)行亞克隆，進(jìn)一步縮小功能片段，發(fā)現(xiàn)抗性菌株有兩個(gè)基因發(fā)生突變。兩基因分別為raxR2基因和conserved hypothetical protein(Chp)基因發(fā)生突變。其中raxR2基因有7個(gè)堿基發(fā)生突變，但未造成氨基酸序列變化；Chp基因發(fā)生一個(gè)堿基突變，引起了氨基酸變化(Val變成Gly)。
　　 3.水稻白葉枯病菌和條斑病菌鏈霉素抗性機(jī)理研究
　

6、　 通過(guò)室內(nèi)紫外誘變和藥劑馴服獲得了水稻條斑病菌和白葉枯病菌鏈霉素抗性突變體。這些突變體可以在含100μg/mL鏈霉素平板上生長(zhǎng)，而敏感菌株在5μg/mL濃度下則不能生長(zhǎng)。通過(guò)田間致病力測(cè)定，發(fā)現(xiàn)抗性菌株在水稻葉片上的致病力與敏感出發(fā)菌株無(wú)明顯差異。從水稻條斑病菌和白葉枯病菌野生敏感菌株及室內(nèi)誘導(dǎo)抗性菌株中分別擴(kuò)增到編碼核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)全序列，序列分析表明rpsL基因中第43位或第88位氨基酸由賴(lài)氨酸(AAG)突變

7、為精氨酸(AGG)。rpsL基因全長(zhǎng)375bp，編碼125個(gè)氨基酸。序列分析結(jié)果表明水稻條斑病菌與水稻白葉枯病菌rpsL基因同源性達(dá)97％，編碼氨基酸同源性達(dá)100％；與柑橘潰瘍病菌氨基酸同源性達(dá)98％，與大白菜軟腐病菌氨基酸同源性達(dá)99％。設(shè)計(jì)合成1對(duì)含有酶切位點(diǎn)(EcoRⅠ)的特異性引物，從抗藥性菌株UV-R-1(含rpsL基因43位點(diǎn)突變)和UV-R-3(含rpsL基因88位點(diǎn)突變)中擴(kuò)增出含啟動(dòng)區(qū)的rpsL基因，成功構(gòu)建了重組質(zhì)

8、粒pUFRRS和pUFRRX。功能驗(yàn)證證明，質(zhì)粒pUFRRS和pUFRRX能夠互補(bǔ)敏感菌株的抗藥性功能，結(jié)合子RS1、RS2、RS3、PS1、PS2對(duì)鏈霉素敏感性測(cè)定結(jié)果證實(shí)rpsL基因序列發(fā)生點(diǎn)突變是水稻白葉枯病菌和條斑病菌對(duì)鏈霉素產(chǎn)生抗藥性的主要原因。同時(shí)轉(zhuǎn)化子的致病力與敏感出發(fā)菌株和抗藥突變體的致病力無(wú)明顯差異。
　　 4.水稻白葉枯病菌、條斑病菌、大白菜軟腐病菌以及柑橘潰瘍病菌抗藥基因rpsL的分子檢測(cè)
　　 通

9、過(guò)室內(nèi)藥劑馴化和紫外誘導(dǎo)，獲得大白菜軟腐病菌鏈霉素抗性突變體12個(gè)，柑橘潰瘍病菌突變體11個(gè)，番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌突變體12個(gè)。分別比較番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜軟腐病菌鏈霉素抗性突變體與他們的敏感親本菌株的序列，發(fā)現(xiàn)所有抗鏈霉素菌株的rpsL基因中第43位或第88位氨基酸均由賴(lài)氨酸(AAG)突變?yōu)榫彼?AGG)。由于rpsL基因43位點(diǎn)是MboⅡ的酶切位點(diǎn)，因此通過(guò)PCR-RFLP方法可以檢測(cè)出上述細(xì)菌rpsL基因43位