利用改進(jìn)的最小表達(dá)框技術(shù)獲得抗旱轉(zhuǎn)基因小麥.pdf

1、因基因槍共轉(zhuǎn)化法具有無宿主限制和不受季節(jié)時(shí)間的限制、簡單易操作等優(yōu)點(diǎn)，目前基因槍共轉(zhuǎn)化法約占所有轉(zhuǎn)基因作物65％以上。采用最小表達(dá)框技術(shù)轉(zhuǎn)化植物，只導(dǎo)入了包含啟動子、編碼序列及終止子的表達(dá)框序列，不含載體骨架序列，規(guī)避了可能由骨架序列引起的安全風(fēng)險(xiǎn)。核基質(zhì)結(jié)合區(qū)序列 SAR（scaffold attachment region）是真核細(xì)胞核的重要組成部分，主要充當(dāng)遺傳信息的傳播和轉(zhuǎn)錄的功能，具有增強(qiáng)鄰近元件的配合，使兩個(gè) SAR之間的基

2、因片段被界定成一個(gè)獨(dú)立的染色質(zhì)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而阻擋鄰近染色質(zhì)區(qū)作用與影響可以提高目的基因的表達(dá)特性。為了提高外源基因表達(dá)的穩(wěn)定性，本研究通過在最小表達(dá)框序列兩端添加 SAR序列，構(gòu)建了表達(dá)載體，建立了適合小麥轉(zhuǎn)化的最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。本研究中，首先,以 GUS為目的基因，除草劑抗性基因 Bar為篩選標(biāo)記基因，對 pSGUS載體進(jìn)行驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，為了創(chuàng)制抗旱轉(zhuǎn)基因小麥新種質(zhì)，以來自大豆的抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因 GmDREB3為目的基因

3、，Bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記基因，對濟(jì)麥22、石366、石 B074056、石15四個(gè)受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體結(jié)果如下：
　　1．科農(nóng)199為受體進(jìn)行了基因槍共轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，轟擊 l067個(gè)幼胚，獲得40株再生植株，PCR檢測獲得陽性植株9株。隨機(jī)取4株（編號為 M2-1、M2-2、M2-3和M2-4）進(jìn)行報(bào)告基因 GUS染色，均在幼根組織染色。進(jìn)一步對該4個(gè)株系的T1代的胚乳（隨機(jī)取3粒）和小花（隨機(jī)取3朵）進(jìn)行報(bào)告基因 GUS表達(dá)檢測，發(fā)現(xiàn)在

4、胚乳和小花均能檢測到 GUS的表達(dá)，表明利用改良的最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化技術(shù)，外源基因可以在受體中穩(wěn)定表達(dá)。
　　2．GmDREB3基因轉(zhuǎn)化受體小麥濟(jì)麥22，通過 PCR檢測獲得陽性植株30株，隨機(jī)取6株進(jìn)行 RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)外源基因均能在轉(zhuǎn)錄水平上得到表達(dá)，進(jìn)一步通過 real-time PCR分析轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示所得到的陽性植株含有較低的拷貝數(shù)。以上結(jié)果表明，在最小表達(dá)框兩端加上 SAR序列后，可以顯著提高轉(zhuǎn)化片段的

5、完整性及穩(wěn)定性，減少目標(biāo)基因整合的拷貝數(shù)。
　　3．為確定受體對載體片段的影響及不同受體的表達(dá)水平，GmDREB3基因近一步轉(zhuǎn)濟(jì)麥22、石366、石 B074056、石15受體小麥，陽性率分別為：0.53%，0.80%，0.99%和0.31%，表明以石 B074056為受體轉(zhuǎn)化效率最高，可見不同受體對加 SAR序列最小表達(dá)框轉(zhuǎn)化率也有影響。
　　4．經(jīng)過對以濟(jì)麥20為受體的轉(zhuǎn)基因 GmDREB1材料 MG3a、MG7和MG1