楊樹潰瘍病(Botryosphaeria dothidea)典型病斑的蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、楊樹是非常重要的用材林樹種。楊樹潰瘍病是危害楊樹枝干的主要病害之一，研究楊樹潰瘍病的致病機(jī)制有重大的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)意義，蛋白質(zhì)組學(xué)作為后基因組時(shí)代的新興研究領(lǐng)域，是當(dāng)今生物學(xué)研究中揭示物質(zhì)生命現(xiàn)象的重要手段，是林木生物學(xué)的重要內(nèi)容。對(duì)楊樹潰瘍病的典型病斑進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，對(duì)闡明楊樹潰瘍病的致病機(jī)制以及楊樹的抗病機(jī)制有重要的推動(dòng)作用；也為其他林木與病原菌互作的蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了參考。本研究以野外采集的、9月份發(fā)病高峰期的107楊樹樹皮健康

2、組織和潰瘍病斑為實(shí)驗(yàn)材料，建立了一種適合楊樹樹皮的蛋白質(zhì)提取方法，并運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法對(duì)楊樹與潰瘍病菌互作所產(chǎn)生典型病斑的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分離和分析，對(duì)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行了質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，主要獲得以下研究結(jié)果：
　　 1.建立了一種適合楊樹樹皮蛋白質(zhì)的提取方法，針對(duì)蛋白質(zhì)提取過程中的樣品沉淀時(shí)間、所加裂解液的量和振蕩裂解時(shí)間，設(shè)置不同梯度，通過實(shí)驗(yàn)反復(fù)驗(yàn)證，確定了蛋白質(zhì)提取的最優(yōu)沉淀時(shí)間為12h；每克樣品干粉中加入裂解液

3、的最優(yōu)量為500μL；最優(yōu)裂解時(shí)間為3h。確定了效果良好的等電點(diǎn)聚焦(IEF)程序參數(shù)：Grad500V，2h；Grad1000V，1h；Grad8000V，20000vh；Step8000V，60000vh；本研究選擇pH4-7、長(zhǎng)度為24cm的膠條，濃度為12％分離膠分離楊樹樹皮蛋白，效果良好。
　　 2.通過對(duì)楊樹樹皮健康組織和病斑組織的雙向電泳圖譜進(jìn)行分析，共發(fā)現(xiàn)54個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)，其中有21個(gè)是發(fā)生質(zhì)變的差異蛋白點(diǎn)

4、；有17個(gè)質(zhì)變的差異蛋白點(diǎn)為楊樹樹皮健康組織的蛋白質(zhì)凝膠圖譜所特有；剩余的5個(gè)質(zhì)變差異蛋白點(diǎn)為楊樹樹皮病斑組織的蛋白質(zhì)圖譜所有；有33個(gè)是發(fā)生量變的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)，以健康楊樹樹皮的蛋白質(zhì)圖譜為對(duì)照，病斑組織蛋白質(zhì)圖譜有22個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)量上調(diào)，11個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)量下調(diào)。
　　 3.選擇其中的46個(gè)差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，通過Mascot軟件分析和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢結(jié)果，確定了這些差異蛋白點(diǎn)的等電點(diǎn)和分子量等基本屬性，以檢測(cè)結(jié)果得分

5、≥73為標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)有21個(gè)蛋白點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，其中有6差異個(gè)蛋白點(diǎn)基本上得到明確的鑒定，其他大多為預(yù)測(cè)蛋白。這6個(gè)差異蛋白點(diǎn)分別是：抗壞血酸過氧化物酶(APX)、熱休克蛋白(HSP)、纖維素合成酶(CesA)、富含亮氨酸重復(fù)序列型受體蛋白激酶(LRR-RLK)、樹皮儲(chǔ)存蛋白(BSP)和烯醇化酶(enolase)。通過對(duì)這些差異蛋白點(diǎn)功能的分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白點(diǎn)主要涉及到楊樹的防御應(yīng)答、信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)控、氨基酸代謝、能量代謝、轉(zhuǎn)錄等多