雞新城疫與傳染性支氣管炎病毒膠體金聯(lián)檢試紙條的研究.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)又名亞洲雞瘟，與雞傳染性支氣管炎(InfectiousBronchitiS，IB)同屬禽類的高度接觸性呼吸道傳染病。這兩種病毒性疾病主要侵害一些家禽以及野禽，并在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　 新城疫病毒(Newcastle Disease virus，NDV)全基因共編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，其中血凝素神經(jīng)氨酸糖蛋白HN是重要的功能性蛋白，常作為免疫原成分

2、應(yīng)用于各種研究中；雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious BronchitiS virus，IBV)全基因編碼四種結(jié)構(gòu)蛋白，其中核衣殼蛋白N作為IBV的內(nèi)部蛋白也同時具有良好的免疫原性。因此，本試驗選用NDV的HN和IBV的N作為免疫原制備單克隆抗體，并將其應(yīng)用于膠體金免疫層析技術(shù)中，建立鑒別診斷新城疫和雞傳染性支氣管炎的方法，為快速、準(zhǔn)確地鑒別診斷這兩種雞的主要呼吸道疾病提供有效的臨床檢測方法。主要的試驗結(jié)果如下：
　　

3、1.單克隆抗體的制備與純化
　　 利用NDV-HN基因去信號肽和跨膜區(qū)重組質(zhì)粒(其目的片段大約為1590bp)誘導(dǎo)表達(dá)得到大小約為80KDa的蛋白；同時利用IBV-N基因全長重組質(zhì)粒(其目的片段大約為1230bp)誘導(dǎo)表達(dá)得到大小約為80KDa的蛋白。分別應(yīng)用這兩種蛋白免疫BALB/c小鼠，三免后測定血清效價均達(dá)到1:16000，經(jīng)過融合、克隆，得到4株NDV-McAb，分別命名為：2F2B2、4A10F11、4E2A9、4F4

4、E2，同時得到1株IBV-McAb，命名為2E2A2。分別用ELISA和HI的方法測定這5株單抗的效價結(jié)果顯示：4株NDV-McAb的ELISA效價為1.6×104～3.2×104，HI的檢測效價為29～212；IBV-McAb的ELISA效價為1.6×104，HI的檢測效價為27。其中抗NDV單抗具有良好的特異性。IBV-2E2A2單抗僅與AIV-H9有微弱的反應(yīng)，而與NDV、AIV-H5、ILTV、IBDV、EDS-76均不發(fā)生交叉

5、反應(yīng)。
　　 2.多克隆抗體的制備及純化
　　 將本實驗室分離保存的腎型傳支-孝感分離株。經(jīng)SPF雞胚增殖純化后，取少量的濃縮液加入1%胰酶，在37℃條件下作用1h，采用HA檢測其效價為213。用該病毒濃縮液與弗氏佐劑進(jìn)行乳化，免疫20日齡無免艾維茵肉雞，三免后測得血清效價均高于1:8000。加強免疫后第10d，經(jīng)心臟采血獲得陽性血清，采用飽和硫酸銨法粗提，經(jīng)葡聚糖凝膠層析柱純化，最終獲得濃度為8 m9/ml的雞抗IBV

6、多克隆抗體。以NDV、IBV、AIV-H5、AIV-H9、ILTV、IBDV、EDS-76作為包被原，采用間接ELISA的方法檢測其特異性良好。
　　 3.快速鑒別檢測試紙條的建立
　　 本試驗采用檸檬酸三鈉還原法，制備出的膠體金顆粒均一、穩(wěn)定，最大吸收峰在523nm處。選用單克隆抗體標(biāo)記膠體金，首先得到了反應(yīng)的最適pH值為8。測定其最適標(biāo)記抗體蛋白量為7.2μg/ml。選取另外一株NDV-McAb和已制備的IBV-多抗

7、，采用0.01mol/LpH7.2PB+3%Methanol+0.1%Sucorse作為包被液分別將其包被于NC膜上，封閉液最終選擇為0.1MpH7.4PBS+2.5%蔗糖+2%BSA+0.02%NaN3+0.75%聚乙烯吡咯烷K30(PVPK30)+0.5% Teewn-20+0.5% PEG-2000。對已組裝制備的試紙條進(jìn)行了特異性檢測，結(jié)果顯示試紙條的特異性良好，不與AIV-H5、AIV-H9、ILTV、IBDV、EDS-76病

8、毒發(fā)生交叉反應(yīng)。并且分別在NDV-HI標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋10000倍，IBV-HI標(biāo)準(zhǔn)抗原稀釋640倍的情況下能夠檢測到條帶，說明靈敏度較高，在4℃條件下可至少保存35d。
　　 4.臨床檢測實驗
　　 動物試驗劃分4個試驗組，第一組為新城疫組，第二組為傳支組，第三組為混合組，第四組為對照組。在攻毒后第三天采集喉頭和泄殖腔棉拭子，可檢測到新城疫病毒，第五天可檢測到傳支病毒，在攻毒后第10天，宰殺并剖檢病雞，發(fā)現(xiàn)傳支組只在呼吸道