白僵菌菌株退化的RAPD分析.pdf

1、白僵菌Beauveriabassiana是當(dāng)前世界上研究和應(yīng)用最多的一種廣譜蟲(chóng)生真菌,其致病力強(qiáng),殺蟲(chóng)譜廣,對(duì)溫血?jiǎng)游餆o(wú)害且容易培養(yǎng),在我國(guó)應(yīng)用白僵菌防治農(nóng)、林害蟲(chóng)的種類(lèi)和面積均居世界首位。然而在研究和應(yīng)用過(guò)程中,菌株繼代培養(yǎng)一定代數(shù)后經(jīng)常出現(xiàn)生產(chǎn)性狀的退化,如產(chǎn)孢量減少、殺蟲(chóng)毒力降低等,嚴(yán)重影響了應(yīng)用白僵菌進(jìn)行害蟲(chóng)生物防治的應(yīng)用效果。菌種退化問(wèn)題一直是困擾著微生物學(xué)工作者的難題,也是許多科研工作者多年來(lái)致力于解決的問(wèn)題。通?？蒲泄ぷ髡?/p>

2、只是從菌種保藏方法和培養(yǎng)條件的改善、控制傳代次數(shù)、人工強(qiáng)制形成異核體、篩選穩(wěn)定的高毒力單孢株等方面去控制菌株的退化速度,并未從根本上解決問(wèn)題。而菌種變異主要是由于遺傳本質(zhì)決定的,最有效的調(diào)控措施是采取生物工程技術(shù)。為弄清白僵菌菌株退化的遺傳學(xué)機(jī)理,有效控制其退化,本研究以桑天牛幼蟲(chóng)高致病性白僵菌菌株為材料,采用RAPD技術(shù)對(duì)正常菌株和退化菌株之間的遺傳變異進(jìn)行初步探索。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的菌種Bb00菌株

3、進(jìn)行復(fù)壯和傳代培養(yǎng)。結(jié)果表明菌株在寄主體內(nèi)復(fù)壯三次以后,產(chǎn)孢量明顯增加,菌絲生長(zhǎng)速率明顯比復(fù)壯前小。傳代培養(yǎng)得到20代菌株,隨著傳代次數(shù)的增加,菌絲生長(zhǎng)速率逐漸增大,菌株的產(chǎn)孢量越來(lái)越低,宏觀上表現(xiàn)出生物學(xué)性狀的退化。
　　 2.對(duì)20代退化菌株進(jìn)行生長(zhǎng)速率、產(chǎn)孢量測(cè)定,結(jié)果表明:隨著傳代次數(shù)的增加,菌絲的日生長(zhǎng)速率逐漸增大。第13代菌落生長(zhǎng)速率突然增加并且在14天時(shí)的生長(zhǎng)量達(dá)到最大值。14d時(shí)菌落直徑達(dá)到8厘米以上的菌株為11

4、-15、17、19、20代。產(chǎn)孢量的測(cè)定結(jié)果表明,傳代次數(shù)越多的菌株產(chǎn)孢能力越小,孢子層較薄,第1代菌株的產(chǎn)孢量最多,為2.64×108/cm2,第20代產(chǎn)孢量最少,為0.61×108/cm2。
　　 3.不同傳代次數(shù)菌株對(duì)桑天牛幼蟲(chóng)的致病力研究表明:不同傳代次數(shù)的菌株對(duì)桑天牛幼蟲(chóng)均有一定的致病力,但侵染率不同。隨著傳代次數(shù)的增加,對(duì)桑天牛幼蟲(chóng)的致病力逐漸減小。接種7d后第一代菌株的致死率最大,達(dá)到91.46％,而第20代菌株的

5、致死率則為26.83%。
　　 4.RAPD-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究,通過(guò)采用L16(45)正交試驗(yàn)及退火溫度和循環(huán)次數(shù)的單因素優(yōu)化,對(duì)反應(yīng)體系中的各因素進(jìn)行優(yōu)化組合。結(jié)果表明,20uLPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序中各因素優(yōu)化組合為:10×Buffer2μL,MgCl2(25mmol/L)2.4uL,四種dNTP(各2.5mmol/L)0.8uL,隨機(jī)引物(10μmol/L)1.4uL,TaqDNA聚合酶(5U/uL)0.4uL,模

6、板DNA(10ng,uL)1uL。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min,94℃變性30s,38℃退火40s,72℃延伸1min,循環(huán)次數(shù)40次,72℃延伸5min。
　　 5.退化菌株DNA多態(tài)性的RAPD分析。通過(guò)相似率公式計(jì)算出各代菌株的相似率為:1代和6代之間的相似率最大為94.86%,1代和12代之間的相似率最小為42.04%,1代和14代、16代、18代、20代的相似率在70%以上,說(shuō)明菌株在6代之前基因組幾乎沒(méi)有變異,12