雞胚肝臟糖脂代謝的品種差異以及雞FTO基因的功能初探.pdf

1、胚胎期，雞的肝臟是其物質(zhì)能量代謝最活躍的組織器官，并且肝臟是唯一一個(gè)所有能量代謝通路和代謝酶都有活性的器官[1]。在雞胚孵化的最后一周，肝臟的脂代謝非?；钴S，比如運(yùn)輸儲(chǔ)存從頭合成的甘油三酯和膽固醇，以及包裹形成極低密度脂蛋白和低密度脂蛋白。此時(shí)，雞的肝臟糖異生具有重要的作用，因?yàn)榇藭r(shí)的雞胚肌肉生長(zhǎng)迅速，且肌肉內(nèi)糖原的存儲(chǔ)也顯著加強(qiáng)，而雞胚的肝臟糖異生是其葡萄糖的唯一來源。不同品種的雞，在生長(zhǎng)和代謝等方面的表現(xiàn)都有很大的不同，但對(duì)于不同品

2、種雞胚胎期肝臟的能量代謝報(bào)道的不是很多。
　　近年，與肥胖相關(guān)的基因FTO被發(fā)現(xiàn)與能量代謝有很大的相關(guān)性，但研究幾乎集中在哺乳動(dòng)物和人，禽類上的研究鮮有報(bào)道，且直接FTO功能的報(bào)道很少，因此本文將品種比較、相關(guān)性分析和細(xì)胞轉(zhuǎn)染兩個(gè)方面研究雞FTO的功能。
　　1.雞胚肝臟糖脂代謝相關(guān)基因和FTO表達(dá)的品種差異
　　選取快速生長(zhǎng)型的白羽羅氏肉雞和慢速生長(zhǎng)型的廣州溫氏黃羽肉雞種蛋，在標(biāo)準(zhǔn)條件下孵化，于18胚齡時(shí)采樣。快速生

3、長(zhǎng)型肉雞的種蛋和18胚齡時(shí)的胚重均顯著高于慢速生長(zhǎng)型肉雞的(P＜0.05)，18胚齡時(shí)血清和肝臟中的甘油三酯(Triglycerol，TG)含量均是快速生長(zhǎng)型肉雞的顯著高(P＜0.05);血清中總膽固醇(Totalcholesterol，Tch)、高密度脂蛋白膽固醇（Highdensitylipoproteincholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（Lowdensitylipoproteincholesterol，LD

4、L-C）的含量均是快速生長(zhǎng)型肉雞的顯著低于慢速生長(zhǎng)型肉雞的(P＜0.05)，而肝臟中Tch的含量無品種差異;血清中葡萄糖（glucose）和乳酸(Lacticacid，LD)的含量是快速生長(zhǎng)型肉雞的顯著高(P＜0.05);脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，脂肪合成的酶如脂肪酸合酶(Fattyacidsynthase，F(xiàn)AS)、乙酰輔酶A羧化酶（AcetylCoAcarboxylase，ACC）和蘋果酸酶(Malicenzyme，ME)以及固醇類調(diào)控

5、元件結(jié)合蛋白1(Sterolregulatorelementbindingprotein1，SREBP-1)的基因表達(dá)在品種間無顯著差異，但脂肪分解酶肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶（Carnitinepalmitoyltransferase，CPT1）的基因表達(dá)是快速生長(zhǎng)型肉雞的顯著高于慢速生長(zhǎng)型肉雞的(P＜0.05);載脂蛋白B(ApolipoproteinB，ApoB)的基因表達(dá)則是快速生長(zhǎng)型肉雞的顯著低(P＜0.05);固醇類調(diào)控元件結(jié)合蛋白2

6、(Sterolregulatorelementbindingprotein2，SREBP-2)和膽固醇分解的酶膽固醇-7α-羥化酶(Cholesterol-7alpha-hydroxylase，CYP7A1)的基因表達(dá)均表現(xiàn)為快速生長(zhǎng)型肉雞的顯著低于慢速生長(zhǎng)型肉雞的（P＜0.05）;同時(shí)，18胚齡時(shí)，快速生長(zhǎng)型肉雞肝臟中胞漿型磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Cytosolicformphosphoenolpyruvatecarboxykinas

7、e，PEPCK-c)和果糖-1，6-二磷酸酶(Fructose-1，6-bisphosphatase，F(xiàn)PB1)的基因表達(dá)均顯著高于慢速生長(zhǎng)型肉雞的(P＜0.05)，但脂肪和肥胖相關(guān)基因FTO(fatmassandobesityassociatedgene，F(xiàn)TO)的基因和蛋白表達(dá)卻在兩品種間無顯著差異;進(jìn)一步的相關(guān)性分析也沒有發(fā)現(xiàn)FTO的表達(dá)與糖脂代謝的相關(guān)基因表達(dá)間有顯著的相關(guān)性。結(jié)果提示，18胚齡時(shí)，快速生長(zhǎng)型內(nèi)雞肝臟脂代謝和糖異

8、生均較慢速生長(zhǎng)型肉雞的活躍，而FTO的表達(dá)似乎與此沒有顯著的相關(guān)性。
　　2.雞胚肝臟糖異生品種差異的分子機(jī)制研究
　　我們之前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，18胚齡時(shí)，快速生長(zhǎng)型肉雞肝臟糖異生關(guān)鍵酶PEPCK-c的基因表達(dá)強(qiáng)于慢速生長(zhǎng)型肉雞，但其表達(dá)的品種差異的具體機(jī)制尚不清楚，即為本部分的研究目的和內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)首先預(yù)測(cè)了雞PEPCK-c基因啟動(dòng)子上的CpG島和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，接著發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMPrespons

9、eelementbindingprotein，CREB1)的基因表達(dá)以及磷酸化的CREB1(pCREB1)的蛋白表達(dá)均為快速生長(zhǎng)型肉雞的顯著高(P＜0.05);ChIP的結(jié)果顯示，快速生長(zhǎng)型肉雞肝臟PEPCK-c基因啟動(dòng)子上結(jié)合有較多的pCREB1（P=0.08）;而IP-IB的結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)FTO可以和pCREB1結(jié)合;PEPCK-c基因啟動(dòng)子的表遺傳修飾在兩個(gè)品種間亦表現(xiàn)有差異，即快速生長(zhǎng)型肉雞PEPCK-c基因CpG島的甲基化水平和

10、組蛋白H3水平較低（P＜0.05），而組蛋白H3的乙?；℉istoneH3acetylation，H3ac）和組蛋白H3賴氨酸27三甲基化（TrimethylatedhistoneH3lysine27，H3K27me3）水平顯著地高(P＜0.05)。結(jié)果提示，18胚齡時(shí)，肉雞肝臟PEPCK-c表達(dá)的品種差異可能主要是由轉(zhuǎn)錄因子pCPEB1的調(diào)節(jié)引起的，而FTO尚未發(fā)現(xiàn)參與其中。
　　3.FTO基因的超表達(dá)和RNA干擾對(duì)雞胚成纖維

11、細(xì)胞DF-1的影響
　　有大量文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)TO與能量代謝相關(guān)，但研究集中在哺乳動(dòng)物和人。而對(duì)于禽類，F(xiàn)TO有怎樣的生物學(xué)功能尚待研究。所以，本章選用雞胚成纖維細(xì)胞DF-1細(xì)胞系，并構(gòu)建雞的FTO超表達(dá)質(zhì)粒(F+)和干擾質(zhì)粒(F-)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，觀察對(duì)DF-1細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染24小時(shí)，F(xiàn)TO并不會(huì)對(duì)DF-1細(xì)胞的細(xì)胞活力造成影響;轉(zhuǎn)染后，F(xiàn)+組的FTO基因和蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，F(xiàn)-組的表達(dá)則顯著低于對(duì)照組

12、(P＜0.05);F+組的糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoidreceptor，GR)、葡萄糖-6磷酸酶（Glucose-6-phosphatase，G6PC）和線粒體型的PEPCK(PEPCK-m)的基因表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而F-組這三個(gè)基因的表達(dá)則顯著低于對(duì)照組(P＜0.05);而與脂代謝、膽固醇代謝、胰島素通路、線粒體功能、氧化應(yīng)激等相關(guān)的基因表達(dá)則無顯著的變化。以上結(jié)果提示，F(xiàn)TO可能主要是影響DF-1

13、細(xì)胞的糖異生功能。
　　4.FTO基因的超表達(dá)和RNA干擾影響DF-1細(xì)胞糖異生的機(jī)制研究
　　我們之前的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FTO對(duì)DF-1細(xì)胞的糖異生的幾個(gè)關(guān)鍵酶有影響，但機(jī)制如何尚不明了。本章同樣采取FTO超表達(dá)(F+)和干擾質(zhì)粒(F-)對(duì)DF-1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染24小時(shí)，F(xiàn)+組細(xì)胞上清中的葡萄糖含量顯著低于對(duì)照組(P＜0.05)，乳酸含量則顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，F(xiàn)-組的這兩個(gè)指標(biāo)則與對(duì)照組無顯著差異;DF-1細(xì)胞

14、中糖原含量表現(xiàn)為F+組顯著高于F-組(P＜0.05)，但F+組和F-組與對(duì)照組均無顯著差異;F+組G6PC的蛋白表達(dá)和酶活均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而F-組與對(duì)照組無差異。G6PC基因啟動(dòng)子上的轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-beta和CREB1的基因表達(dá)均為F+組的顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子只有C/EBP-beta的基因表達(dá)在F-組中均顯著下調(diào)(P＜0.05);C/EBP-bcta和CREB1的蛋白表達(dá)在F+組顯著高

15、于對(duì)照組（P＜0.05），而這兩個(gè)蛋白在F-組均無顯著變化;ChIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，G6PC基因啟動(dòng)子上轉(zhuǎn)錄因子C/EBP-beta和pCREB1的結(jié)合在F+組顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，F(xiàn)-組pCREB1的結(jié)合顯著降低(P＜0.05)，而C/EBP-beta則無顯著變化;IP-IB結(jié)果顯示，F(xiàn)+組FTO結(jié)合了較多的C/EBP-beta蛋白，同時(shí)C/EBP-bcta也結(jié)合了較多的FTO蛋白（P＜0.05），即增強(qiáng)了二者的互作效應(yīng)。以上結(jié)果