中藥黃酮成分復(fù)方及其腸溶微囊的藥理作用研究.pdf

1、黃酮類化合物是一種廣泛存在于自然界的化合物，能夠防治呼吸系統(tǒng)和心腦血管疾病，具有抗癌、抗腫瘤、降低輻射損傷、消炎抑菌等作用，因而受到普遍重視。本研究用通過體內(nèi)試驗(yàn)，研究了不同中藥黃酮成分復(fù)方對雞新城疫疫苗免疫、腸道酶和腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡的影響，篩選出效果最佳的中藥黃酮成分復(fù)方。再將最佳復(fù)方制備成為微囊，通過正交試驗(yàn)設(shè)計，篩選出制備中藥黃酮成分復(fù)方微囊的最佳工藝條件。試驗(yàn)分為以下4個部分:
　　試驗(yàn)Ⅰ中藥黃酮成分復(fù)方對雛雞新城疫疫苗

2、免疫效果的影響
　　為了研究中藥黃酮成分復(fù)方對雞新城疫疫苗免疫效果的影響，將300羽雛雞隨機(jī)分為6組，每組2個重復(fù)，每個重復(fù)25羽:Ⅰ組為空白對照組;Ⅱ組為免疫對照組;Ⅲ組為黃芪多糖對照組;Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ3個組分別為3個中藥黃酮成分復(fù)方組。在14、28日齡時除Ⅰ組外其余各組雞均用雞新城疫低毒力活疫苗（La Sota株）進(jìn)行點(diǎn)眼、滴鼻免疫，2羽份/只。在兩次免疫的前兩天開始3個中藥黃酮成分復(fù)方組飲喂各黃酮成分復(fù)方，15mg/只·d，連續(xù)

3、5d;黃芪多糖組按說明飲服黃芪多糖可溶性粉，連續(xù)5d。分別于首免后第7d(D7)、14d(D14)、21d(D21)和28d(D28)每組隨機(jī)抽取6只心臟采血測定血液淋巴細(xì)胞增殖和血清新城疫血凝抑制抗體效價。于首免后49d，除空白對照組外其余5組雞均肌肉注射NDV強(qiáng)毒10-5(LD50)/0.1mL攻毒，于攻毒前1d和攻毒后第8d檢測血清抗體效價，每天觀察記錄各組雞群的臨床癥狀和死亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個中藥黃酮成分復(fù)方組HI抗體滴度從D2

4、1開始即顯著高于免疫對照組，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率也高于或顯著高于免疫對照組，攻毒后發(fā)病率和死亡率都低于或顯著低于免疫對照組，尤其是淫羊藿。三七-野菊花-黃芩黃酮復(fù)方組(ESWB)更為顯著，其抗體效價和攻毒后死亡率基本與黃芪多糖對照組接近，而保護(hù)率卻略高。表明中藥黃酮成分復(fù)方可以提高雞新城疫疫苗免疫效果和免疫保護(hù)力，以ESWB復(fù)方效果最佳。
　　試驗(yàn)Ⅱ中藥黃酮成分復(fù)方對雞腸道酶活性和微生物菌群的影響
　　試驗(yàn)動物分組處理見試驗(yàn)Ⅰ，第

5、二次免疫用藥結(jié)束后2d，從各組隨機(jī)選取體重相近的6只雞，剖殺后無菌采集十二指腸、空腸、回腸、盲腸和盲直腸結(jié)合處的內(nèi)容物，測定十二指腸、空腸、回腸內(nèi)容物中蛋白酶和淀粉酶的活性，盲腸和盲直腸結(jié)合處內(nèi)容物中腸桿菌和乳酸菌的數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組各腸段蛋白酶活性顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3個對照組（空腸段Ⅲ組與Ⅵ組接近，除外），以Ⅴ組(ESWB)最好;空腸段淀粉酶活性Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，十二指腸段Ⅴ組顯著高于Ⅳ和Ⅵ組。組Ⅴ和Ⅵ盲腸乳酸

6、菌數(shù)顯著高于其他各組;Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組盲直腸結(jié)合處乳酸菌數(shù)高于其他3組，組Ⅴ顯著高于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組;Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組盲直腸結(jié)合處腸桿菌顯著高于Ⅰ和Ⅵ組。表明中藥黃酮成分復(fù)方對于雞腸管消化酶和微生物菌群穩(wěn)態(tài)選擇性作用，可以增強(qiáng)消化酶活性，提升有益菌群數(shù)，改善腸道微生態(tài)平衡。綜合分析，以ESWB復(fù)方（組Ⅴ）效果最好，而疫苗免疫對于提升腸道酶活性和改善微生物菌群沒有作用。
　　試驗(yàn)Ⅲ中藥黃酮成分復(fù)方腸溶微囊的制備及工藝優(yōu)化
　　為了篩選中藥

7、黃酮成分復(fù)方微囊制備的最佳工藝條件，選用羥丙基甲基纖維素酞酸酯(HPMCP)作為囊材、有機(jī)溶媒選用丙酮、連續(xù)相選用液體石蠟、乳化劑選用Span80、分散劑選用硬脂酸鎂制備微囊，以包封率、載藥量和微囊形態(tài)為指標(biāo)，考察HPMCP∶丙酮(M/V)、分散劑的用量、攪拌時間等單因素對微囊指標(biāo)的影響，然后在單因素的基礎(chǔ)上以黃酮∶HPMCP(M/M)(A)、Span80∶液體石蠟(B)和攪拌速度(C)為因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以微囊包封率、載藥量和形態(tài)

8、為指標(biāo)對試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)制備中藥黃酮成分復(fù)方微囊的最佳條件為:黃酮∶HPMCP(M/M)為1∶2.5、HPMCP∶丙酮(M/V)為1.0∶15、分散相∶液體石蠟(N/V)為1∶7、硬脂酸鎂用量為液體石蠟的4％、Span80的用量為液體石蠟的9％，攪拌速度為300r/min。采用最佳條件制備的微囊外觀規(guī)整，粒徑大小在11-50μm之間，平均粒徑為35.77μm，平均包封率為91.72％，平均載藥量為26.84％。
　　試驗(yàn)

9、Ⅳ中藥黃酮成分復(fù)方腸溶微囊對雞體液免疫、抗病毒能力和腸道消化酶活性的影響
　　為了研究中藥黃酮成分復(fù)方微囊對雞體液免疫效果和抗傳染性支氣管炎病毒的影響，將350羽雛雞隨機(jī)分為7組，每組2個重復(fù)，每個重復(fù)25羽:Ⅰ組為空白對照組;Ⅱ組為免疫對照組;Ⅲ組為黃芪多糖對照組;Ⅳ組為中藥黃酮成分復(fù)方對照組;Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ三個組分別為中藥黃酮成分復(fù)方微囊低、中、高劑量組。在14、28日齡時除Ⅰ組外其余各組雞均用雞新城疫低毒力活疫苗（La Sota

10、株）進(jìn)行點(diǎn)眼、滴鼻免疫，2羽份/只。在兩次免疫的前兩天開始拌料給藥，連續(xù)5d;黃芪多糖組按說明服用黃芪多糖可溶性粉，連續(xù)5d。第二次給藥后兩天每組雞隨機(jī)抽取6只，無菌采集十二指腸、空腸、回腸內(nèi)容物測定腸道內(nèi)胰蛋白酶和淀粉酶活性。分別于首免后第7、14、21和28d每組隨機(jī)抽取6只翅靜脈采血測定血清血凝抑制抗體效價。于二免后除Ⅱ組（免疫對照組）外其余各組滴鼻、點(diǎn)眼雞傳染性支氣管炎病毒(EID50)/0.1mL、氣管注射0.5mL攻毒，于攻