鐵觀音茶樹種性分化的分子鑒定及差異表達(dá)基因分離研究.pdf

1、鐵觀音（Camellia sinensis cv.Tie-guanyin）是原產(chǎn)于福建安溪的國(guó)家級(jí)茶樹良種，性狀優(yōu)異，在茶樹育種領(lǐng)域也是優(yōu)良的育種原始材料。近年來鐵觀音茶樹在栽培中表現(xiàn)出一些性狀分化現(xiàn)象，特別是在表型形狀上表現(xiàn)出差異性，影響了鐵觀音茶樹種性純度和經(jīng)濟(jì)性狀的維持。本研究分析了鐵觀音茶樹的形態(tài)學(xué)變異性，基于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析了不同表型性狀的鐵觀音茶樹的差異，構(gòu)建了鐵觀音茶樹的分子指紋圖譜，應(yīng)用cDNA—AFLP技術(shù)對(duì)兩

2、份具有表型典型差異性的鐵觀音茶樹的基因表達(dá)差異進(jìn)行了研究，并對(duì)比了部分差異表達(dá)的基因在兩份鐵觀音茶樹樣本上的相對(duì)表達(dá)量差異，從轉(zhuǎn)錄水平探討了鐵觀音茶樹的性狀分化，為鑒別和保護(hù)純種鐵觀音茶樹品種以及研究分析鐵觀音茶樹的性狀分化提供參考。主要研究結(jié)果如下：
　　1、鐵觀音茶樹表型性狀變異性分析
　　調(diào)查了80株鐵觀音茶樹的部分形態(tài)學(xué)特征，對(duì)樹姿、芽葉顏色、葉緣鋸齒數(shù)、側(cè)脈對(duì)數(shù)、葉片厚度、葉片長(zhǎng)度和葉片寬度7項(xiàng)表型性狀的變異性進(jìn)行

3、分析，結(jié)果表明：鐵觀音茶樹樹姿的變異最大，變異系數(shù)為48.95%，其次為芽葉顏色，變異系數(shù)為36.83%。通過主成分分析提取了3個(gè)可作為判別鐵觀音茶樹表型性狀分化性參考指標(biāo)的主成分。遺傳相似性分析和聚類分析也顯示種性純度較高的鐵觀音茶樹樣本，具有較高的遺傳相似性，并且被聚在一個(gè)類群中。
　　2、不同表型性狀鐵觀音茶樹的分子標(biāo)記差異
　　優(yōu)化建立了 ISSR擴(kuò)增反應(yīng)體系，利用 ISSR技術(shù)分析了包括不同表型鐵觀音茶樹在內(nèi)13份

4、茶樹樣本的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。結(jié)果表明：11條引物在13份茶樹樣本中共擴(kuò)增出91條譜帶，其中45條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比率為49.45%。13份茶樹樣品的其 Nei基因多樣性指數(shù)為0.17，Shannon信息指數(shù)為0.25，表明供試茶樹的遺傳多樣性水平較低。遺傳相似性分析表明13份茶樹樣本的遺傳相似系數(shù)為0.687-0.986，平均為0.805，遺傳親緣關(guān)系較近。聚類分析將供試茶樹分為3大類群，9份供試鐵觀音茶樹被聚在同一類群中，其中

5、兩份種性純度較高的鐵觀音茶樹被聚在同一亞類中，兩份表型性狀發(fā)生變化的鐵觀音茶樹被聚為同一亞類，且這兩個(gè)亞類在同一類群中距離最遠(yuǎn)。
　　3、基于ISSR分子標(biāo)記的鐵觀音茶樹分子指紋圖譜構(gòu)建
　　基于11對(duì)擴(kuò)增效果較好的 ISSR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物多樣性和特異性分析，從中篩選出5對(duì)核心引物，對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜進(jìn)行編碼并組合，構(gòu)建了13份供試茶樹種質(zhì)的分子指紋圖譜，應(yīng)用編碼圖譜可對(duì)供試茶樹進(jìn)行鑒別。基于擴(kuò)增譜帶的特異性，引物 UB

6、C-843可將供試種質(zhì)中的9份鐵觀音茶樹與其他近緣茶樹進(jìn)行區(qū)分，引物 UBC-857可以將兩份種性純度較高的鐵觀音茶樹與其他發(fā)生性狀分化的茶樹種質(zhì)鑒別出來。
　　4、不同表型性狀鐵觀音茶樹的基因表達(dá)差異分析
　　以種質(zhì)性狀純度較高的和發(fā)生明顯表型性狀分化的兩份鐵觀音茶樹為材料（分別命名為鐵觀音茶樹 X和 Y），應(yīng)用 cDNA-AFLP技術(shù)，分析了兩份茶樹樣本基因表達(dá)的差異性，結(jié)果表明：以256對(duì) AFLP引物組合對(duì)樣品進(jìn)行擴(kuò)

7、增，在兩份樣本之間共分離出75條擴(kuò)增穩(wěn)定的差異條帶，其中36條在鐵觀音茶樹X上高表達(dá)，39條在鐵觀音茶樹Y上高表達(dá)。分離回收的差異條帶進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化測(cè)序后獲得63條有效序列，經(jīng) BlastX比對(duì)后得出51條差異序列具有同源相似序列，其中17條與物質(zhì)合成代謝功能相關(guān)，11條和轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能相關(guān)，3條與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，3條與物質(zhì)輸送與傳遞相關(guān)，17條功能未知。
　　5、不同表型性狀鐵觀音茶樹差異表達(dá)基因的熒光定量表達(dá)
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光