譯文--土壤微生物多樣性生態(tài)學(xué)理論，分子技術(shù)的應(yīng)用和轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物的影響

1、<p><b>　　精讀報(bào)告</b></p><p>　　原文：J. M. Lynch. A. Benedetti. H. Insam. M. P. Nuti .K. Smalla . V. Torsvik . P. Nannipieri. Microbial diversity in soil: ecological theories, the contribution of m

2、olecular techniques and the impact of transgenic plants and transgenic microorganisms. Biol Fertil Soils (2004) 40: 363–385</p><p>　　土壤微生物多樣性：生態(tài)學(xué)理論，分子技術(shù)的應(yīng)用和轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物的影響</p><p>　　J.M.Lynch

3、3;A. Benedetti·H. Insam·M.P. Nuti·K.Smalla·V. Torsvik·P. Nannipieri</p><p>　　摘要：本文主要討論了三個(gè)相關(guān)主題：生態(tài)學(xué)理論在土壤研究方面的應(yīng)用，用分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)衡量微生物多樣性以及轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)土壤遺傳多樣性的影響。為慶祝意大利土壤科學(xué)協(xié)會(huì)成立五十周年而在2001年愛(ài)瑞斯舉

4、行的土壤緊急會(huì)議上討論了這些議題。因研究地上生態(tài)系統(tǒng)而建立的生態(tài)學(xué)理論卻忽略了地面以下的系統(tǒng)，盡管后者對(duì)于全球性的營(yíng)養(yǎng)循環(huán)和地球上現(xiàn)存的生命很重要。土壤微生物多樣性對(duì)于很多土壤功能具有決定性的意義，但是在過(guò)去卻很難測(cè)定其主要成分。傳統(tǒng)的分析方法很有效，但是隨著分子學(xué)方法的應(yīng)用，現(xiàn)在既可以檢測(cè)出可培養(yǎng)又可以檢測(cè)出不可培養(yǎng)的微生物物種。盡管取得了一些進(jìn)步，但是土壤微生物多樣性和土壤功能性之間的聯(lián)系仍然是一個(gè)很大的難題。一般關(guān)于遺傳改造的細(xì)菌

5、的研究大部分集中在其在環(huán)境中的留存時(shí)間、在根際的定植能力和生存能力，而不直接涉及微生物多樣性的問(wèn)題。除了與農(nóng)業(yè)實(shí)踐、季節(jié)、田地位置和年代這些相關(guān)的環(huán)境因素以外，人們開(kāi)始越來(lái)越關(guān)注轉(zhuǎn)基因植物對(duì)微生物群落的影響。轉(zhuǎn)基因植物的DNA隨著老化或者退化的植物體或者花粉進(jìn)入土壤。在過(guò)濾器轉(zhuǎn)化、無(wú)菌土壤中和植物中，通過(guò)在實(shí)驗(yàn)室條件下重建去除抗性基因，發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因</p><p>　　關(guān)鍵詞：生物多樣性；DNA；遺傳多樣性；分子

6、學(xué)方法；多聚鏈反應(yīng)</p><p><b>　　1前言</b></p><p>　　生物多樣性是指一系列的動(dòng)植物物種，以及其遺傳物質(zhì)和所屬的生態(tài)系統(tǒng)，它包括生態(tài)系統(tǒng)、物種和基因多樣性。它是時(shí)間（進(jìn)化）和空間（地理分布）作用的結(jié)果。生態(tài)系統(tǒng)多樣性是指棲息地、生物群落和含有各種生物生存和進(jìn)化的生態(tài)系統(tǒng)的數(shù)量和豐度。生態(tài)系統(tǒng)由互相依存的物種群落以及與其相關(guān)的自然環(huán)境所組成，

7、其大小不一。物種多樣性是指一定區(qū)域內(nèi)的物種的數(shù)量和豐度，并且這里的物種是指（事實(shí)上或者潛在的）能夠種內(nèi)交配并繁殖產(chǎn)生形態(tài)相似的后代的一群個(gè)體的集合。相同物種的個(gè)體之間無(wú)論相似或者不相似，但是對(duì)于每個(gè)物種而言，所有的個(gè)體都必須具有該物種的獨(dú)特特征。但是，這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的定義并不適用于無(wú)性繁殖的生物（例如細(xì)菌和病毒）。遺傳多樣性是指一個(gè)物種內(nèi)的基因和基因型的變化。它包括生存于地球上的所有動(dòng)植物和微生物的全部遺傳信息。物種由具有不同遺傳特征的個(gè)體組

8、成。根據(jù)現(xiàn)代進(jìn)化理論，遺傳密碼的變異性和適應(yīng)性使得單個(gè)物種逐步進(jìn)化并且能夠在變化的環(huán)境中生存。</p><p>　　諸多土壤問(wèn)題例如土壤流失、土壤退化和土壤污染等，居于人類在第三個(gè)一千年中為保護(hù)地球和保證人類生存必須解決的15個(gè)危機(jī)之中。雖然由于城市化發(fā)展、侵蝕、森林采伐和污染的蔓延，每年損失上百萬(wàn)公頃的土地，但是，這個(gè)問(wèn)題一直沒(méi)有受到應(yīng)有的重視。大量的微生物棲居于土壤中并且具有強(qiáng)大的代謝能力，這使得土壤成為一個(gè)

9、十分神秘的生物學(xué)系統(tǒng)。因此，土壤中微生物特性往往比物理或者化學(xué)性質(zhì)對(duì)人工管理和環(huán)境條件的變化更敏感。土壤微生物群的組成變化對(duì)土壤功能完整性很關(guān)鍵。一篇最近的文獻(xiàn)（Nannipieri等.2003）綜述了土壤微生物群落、其多樣性以及其功能之間的相互關(guān)系。該文討論了像低pH值和污染物等環(huán)境壓力對(duì)土壤微生物多樣性和土壤功能的影響，但是未涉及轉(zhuǎn)基因生物的影響。關(guān)于這個(gè)問(wèn)題，已經(jīng)引起了一些相關(guān)的科學(xué)討論、公眾關(guān)注和國(guó)際相關(guān)機(jī)構(gòu)的參與，也有相關(guān)的國(guó)

10、內(nèi)或國(guó)際法律法規(guī)的建立。</p><p>　　為慶祝意大利土壤科學(xué)協(xié)會(huì)成立五十周年，2001年我們?cè)谝獯罄膼?ài)瑞斯召開(kāi)了土壤緊急會(huì)議。本篇綜述即整合了許多此次會(huì)議上演講者的投稿。一篇有關(guān)菌根對(duì)土壤健康和肥力影響的綜述已經(jīng)作為學(xué)術(shù)論文發(fā)表。這些投稿都有一個(gè)共識(shí)，那就是，當(dāng)討論土壤危機(jī)時(shí)，土壤微生物多樣性是其中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，因?yàn)橥寥牢⑸锝Y(jié)構(gòu)和功能多樣性對(duì)土壤肥力有影響。本文討論了檢測(cè)土壤微生物多樣性的許多分子生物

11、學(xué)方法，尤其關(guān)注分子生物學(xué)工具和它們?cè)诜治鐾寥牢⑸锒鄻有苑矫娴木薮笞饔?。分子生態(tài)學(xué)正在突飛猛進(jìn)的發(fā)展，分子工具靶標(biāo)功能基因?qū)?huì)彌補(bǔ)多樣性-結(jié)構(gòu)信息和微生物活力之間的空缺，這只是時(shí)間的問(wèn)題。該文也將討論生態(tài)學(xué)理論在土壤研究中的應(yīng)用，盡管這些理論一般只適用于地上系統(tǒng)，但是由于微生態(tài)概念的發(fā)展這些顯得日益重要。本文討論的其他方面有揭露土壤微生物對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的影響，因?yàn)槿藗冊(cè)絹?lái)越關(guān)注轉(zhuǎn)基因生物在開(kāi)放性環(huán)境中的使用，例如農(nóng)業(yè)土壤。在這點(diǎn)上，有關(guān)

12、轉(zhuǎn)基因DNA在土壤中殘留的研究已經(jīng)考慮到與植物相關(guān)的細(xì)菌與轉(zhuǎn)基因DNA之間的轉(zhuǎn)化。</p><p>　　2土壤微生物多樣性和功能多樣性和生態(tài)學(xué)理論的作用</p><p>　　迄今為止，生態(tài)學(xué)理論一直致力于研究地上系統(tǒng)。盡管土壤微生物通過(guò)營(yíng)養(yǎng)循環(huán)、分解作用和能量循環(huán)在生態(tài)系統(tǒng)功能扮演著很重要的角色，土壤體系忽略了當(dāng)代生態(tài)學(xué)理論的發(fā)展。在此，我們討論土壤微生物研究如何促進(jìn)生態(tài)學(xué)理論的發(fā)展，反過(guò)

13、來(lái)這些理論又將如何促進(jìn)我們更好的了解地下系統(tǒng)。</p><p>　　微生物多樣性通常被認(rèn)為是不同分類的生物個(gè)體的數(shù)量以及它們?cè)诜诸悓W(xué)中的分布。本文將此概念擴(kuò)大，在生物變型級(jí)別以下用高流量分析或者整體性的工具來(lái)評(píng)估個(gè)體多樣性。這包括在基因組學(xué)和蛋白組學(xué)水平上通過(guò)獲得活體信息成像來(lái)研究個(gè)體細(xì)胞。整體性的工具也適用于研究單個(gè)微生物細(xì)胞和群落相對(duì)于環(huán)境的功能多樣性。這個(gè)延伸的觀點(diǎn)似乎更適合于土壤環(huán)境的復(fù)雜性。</p

14、><p>　　Shannon-Weaver指數(shù)（H’）通常以以下形式使用：</p><p>　　H’=-Σ(ni/N)log(ni/N)=-Σpi(logpi)</p><p>　　根據(jù)Odum的觀點(diǎn)，ni是指每個(gè)物種的重要值，N是指總的重要值，ni是指每個(gè)物種的重要性概率（ni/N）。這樣，H’把多樣性的豐富度和平等度成分都考慮在內(nèi)。就群落水平生理學(xué)成像而言，可操作單

15、元物種被可操作單元能力替代，以降低某一化合物。</p><p>　　在景觀水平上來(lái)講，人們對(duì)多樣性的定義有不同的看法。Whittaker建議將某一生活環(huán)境的群落的物種多樣性（α-多樣性），比率、物種變化隨生活環(huán)境梯度變化的程度（β-多樣性）和同一系列生活環(huán)境的物種豐度（γ-多樣性）區(qū)分開(kāi)來(lái)。從傳統(tǒng)的生境多樣性來(lái)看似乎合理，所以這個(gè)概念也可能用于描述土壤微生物多樣性的概念。然而，土壤生物量被界定為一種三維立體多樣性

16、，包括根圍和絕大部分土壤、大團(tuán)聚體和微小聚體、大孔徑和小孔徑以及不同范圍等之間的可能性差異（圖一）。事實(shí)上，在一塊土壤中，有許多的微生境，例如根際、根圍、碎石、腐殖質(zhì)或大塊土壤。土壤在很大程度上是典型的巨大的分層生境，有不同水平層次的范圍，每一個(gè)范圍都可以視為一個(gè)獨(dú)立的整體?，F(xiàn)在仍然不知道這些微生境多樣性是如何并入土壤整體的多樣性的。</p><p>　　圖1 根據(jù)Whittaker的觀點(diǎn)，生態(tài)系統(tǒng)多樣性必須在不

17、同的水平進(jìn)行觀察：一個(gè)棲息群落的物種多樣性（α-多樣性）；隨棲息地梯度變化物種變化的速率和程度（β-多樣性）；一系列棲息地的物種豐度（γ-多樣性）。另外，在土壤中，多樣性的空間變化跟根圍和大塊土、大塊土壤和顆粒土壤、大孔隙和小孔隙和不同的范圍等有著很重要的關(guān)系</p><p>　　我們都知道有很多因素會(huì)影響多樣性，至少在理論上會(huì)影響。這些因素有食物關(guān)系、生活環(huán)境時(shí)間和空間的差異、干擾和富營(yíng)養(yǎng)化。其中有消極的作用如

18、壓力，積極的作用如資源多樣性或生物之間的相互影響（圖二）。對(duì)多樣性的積極影響可以增加土壤微生物的穩(wěn)定性、彈力、抵抗力甚至生產(chǎn)力。</p><p>　　圖2 外界因素決定多樣性，反過(guò)來(lái)影響生態(tài)系統(tǒng)</p><p>　　特性，像穩(wěn)定性、抵抗力、豐富度和生產(chǎn)力</p><p>　　生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性相關(guān)理論的出現(xiàn)已經(jīng)有近50年了，并且被認(rèn)為是早期生態(tài)學(xué)理論的核心法

19、則。MacArthur在1995年發(fā)表的一篇關(guān)于動(dòng)物種群波動(dòng)和穩(wěn)定性衡量的文獻(xiàn)中假設(shè)，群落穩(wěn)定性將會(huì)隨著食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)而增加，而不是某一物種的個(gè)體生態(tài)學(xué)特性。其前提是，在一個(gè)具有大量能量途徑的生態(tài)系統(tǒng)中單一物種的數(shù)量變化對(duì)其它物種的影響要比在一個(gè)能量途徑少的生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)生相同變化時(shí)的影響要小。MacArthur使用了一個(gè)簡(jiǎn)單的食物網(wǎng)模型來(lái)說(shuō)明多樣性對(duì)穩(wěn)定性的影響，并且突然改變一個(gè)群落成員的數(shù)量作為干擾。他對(duì)穩(wěn)定性的定義就是依據(jù)群落抵抗外界

20、某一干擾的能力（圖3）。May挑戰(zhàn)MacArthur的假設(shè)并且說(shuō)明這種干擾應(yīng)該是絕對(duì)值，在這種情況下兩個(gè)群落對(duì)于干擾的敏感程度是相同的。由于支持競(jìng)爭(zhēng)性假設(shè)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)仍然存有異議，所以30年后這場(chǎng)爭(zhēng)論依然沒(méi)有解決。</p><p>　　圖3 MacArthur(1995，左)的食物網(wǎng)模型，May(1973,右)的。MacArthur假設(shè)當(dāng)一個(gè)低多樣性（L）的群落（這里，兩個(gè)成員）在受到外界干擾，如一個(gè)群落成員減少5

21、0%，這種干擾比對(duì)一個(gè)高多樣性的群落（H,20個(gè)物種）來(lái)說(shuō)影響要大。所以，高多樣性的群落會(huì)更加穩(wěn)定。根據(jù)的May的觀點(diǎn)，干擾應(yīng)該用絕對(duì)值，這樣的話這兩個(gè)群落對(duì)于干擾受到的影響都是相同的。</p><p>　　自從MacArthur的食物網(wǎng)模型出現(xiàn)后，人們提出了許多的生態(tài)學(xué)理論或者模型來(lái)解釋多樣性-穩(wěn)定性或者多樣性-生產(chǎn)力之間的關(guān)系。我們將討論其中的資源不均一性假設(shè)和保險(xiǎn)假設(shè)。</p><p&g

22、t;<b>　　資源不均一性假說(shuō)</b></p><p>　　該假設(shè)說(shuō)明當(dāng)一個(gè)區(qū)域在資源可利用性方面均一的貧瘠時(shí)，它將很難保持許多物種并且它的生產(chǎn)力也將很低（圖4）。該假設(shè)認(rèn)為，隨著生境的平均質(zhì)量的提高，資源的空間變化性和多樣性也將增加，因此導(dǎo)致生產(chǎn)力和多樣性增加。然而，超過(guò)某一點(diǎn)，恰恰相反，資源不均一性和多樣性會(huì)減少。這是因?yàn)樵谶@種條件下具有優(yōu)勢(shì)的物種在各處有利的小生境中都會(huì)受到偏愛(ài)。&l

23、t;/p><p>　　圖4 資源不均一性假說(shuō)（Tilman 1982），在地域、區(qū)域和全球規(guī)模的角度。</p><p>　　比如說(shuō)，Hall等發(fā)現(xiàn)資源不均一性和植物多樣性之間存在一種駝背形的關(guān)系。但是，這種駝背形的關(guān)系僅僅適用于局部的和區(qū)域性的規(guī)模，當(dāng)在全球規(guī)模水平時(shí)，能源-豐富度關(guān)系隨著能源單調(diào)遞增。微生物多樣性和能源之間的關(guān)系尚不清楚，但是，從許多植物的特定微生物群看來(lái)，由于微生物的資源不

24、均一性增加所導(dǎo)致的植物多樣性的增加，微生物多樣性也會(huì)隨著增加。</p><p><b>　　保險(xiǎn)假說(shuō)</b></p><p>　　根據(jù)保險(xiǎn)假說(shuō)，通過(guò)抵抗干擾的緩沖效應(yīng)（減少當(dāng)前生產(chǎn)力變化）和性能增強(qiáng)效應(yīng)（增加當(dāng)前平均生產(chǎn)力），物種豐富度對(duì)生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力產(chǎn)生正面的影響。這種效應(yīng)是由單個(gè)物種對(duì)波動(dòng)的反應(yīng)、反應(yīng)的非同步性程度和反應(yīng)的具體形式所決定。由此推知，特別是在像季節(jié)性

25、的干旱或者溫度周期性變化等這些外部因素變化強(qiáng)烈的氣候區(qū)，多樣性顯得很重要。那些在機(jī)能上冗余的物種隨著時(shí)間的變化也不再有很多。Griffiths等證實(shí)，當(dāng)土壤微生物多樣性很低時(shí)，面對(duì)短時(shí)間的壓力（短時(shí)間40℃）微生物功能性恢復(fù)受到消極的影響。在另一方面，在持久的壓力時(shí)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何的恢復(fù)；但是對(duì)于持久的壓力微生物多樣性高的土壤比低的抵抗力要好。</p><p>　　生態(tài)系統(tǒng)有兩大特性：結(jié)構(gòu)和功能。植物和動(dòng)物水平的結(jié)構(gòu)

26、比土壤微生物水平的結(jié)構(gòu)要明顯。是不是知道誰(shuí)在負(fù)責(zé)有機(jī)物的降解很重要呢？或者說(shuō)能不能充分的確定大量的生化途徑是否在正常進(jìn)行？如果是這樣的話，那么功能多樣性將比結(jié)構(gòu)多樣性更加重要。但是有一種共識(shí)就是恒定的環(huán)境下極少數(shù)的物種對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)功能是必需的，在變化的環(huán)境下大量的物種對(duì)于維持生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程穩(wěn)定性很有必要。根據(jù)Giller等，如果微生物多樣性改變后，土壤微生物的有用的冗余程度將會(huì)導(dǎo)致對(duì)土壤微生物群落沒(méi)有影響。如果大量的物種負(fù)責(zé)簡(jiǎn)單的功能，任

27、何物種的消失對(duì)于土壤過(guò)程都不會(huì)有任何的影響，因?yàn)槠渌挠袡C(jī)體會(huì)填充這個(gè)功能空隙。當(dāng)然，這對(duì)于特殊的功能是不使用的，例如線蟲能抵抗燕麥全蝕病菌。這種功能只屬于單個(gè)物種（熒光假單胞桿菌）并且取決于單一的功能——產(chǎn)生2，4-DAPG。</p><p><b>　　3土壤功能性</b></p><p>　　許多方法可以用來(lái)檢測(cè)土壤中的微生物過(guò)程或者酶反應(yīng)速率。絕大多數(shù)方法得出

28、的是可能的活力，而不是真實(shí)的，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)是在充足的底物濃度、最優(yōu)的pH值、溫度值和通常在土壤泥漿里的條件下進(jìn)行。而原來(lái)pH值和底物濃度并不是最優(yōu)的，并且溫度和濕度在浮動(dòng)變化。用14C標(biāo)記的化合物監(jiān)測(cè)C氧化為CO2或者用15N富集的化合物監(jiān)測(cè)土壤中15N的分布，具有代表性的這兩個(gè)例子可以提供土壤生物過(guò)程的數(shù)量分析。Nannipieri等討論了例如土壤呼吸、酶活力、硝化作用等傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn)和不足。</p><p>　　

29、在土壤生態(tài)學(xué)中變得日益重要的一個(gè)有效方法就是CLPP（群落水平生理學(xué)模型）。這種方法采用了包含95種C源的微平板。一個(gè)微生物群落對(duì)它的利用方式可以潛在的提供這個(gè)群落的功能信息，也可以獲得多樣性參數(shù)，例如H’或者分解代謝的多功能性。但是，這種方法有許多的缺點(diǎn)，它是培養(yǎng)基依賴性的，并且隨著培養(yǎng)微生物群落結(jié)構(gòu)的組成會(huì)發(fā)生變化。此外，用這種方法不能檢測(cè)出真菌對(duì)土壤功能的作用。Degens和Harris在測(cè)量土壤微生物群落對(duì)這些化合物的利用方式時(shí)

30、使用了土壤短期反應(yīng)方法，并且加入了氨基酸、羧酸、碳水化合物和有機(jī)物（底物誘導(dǎo)呼吸）以克服上述缺陷（圖5）。</p><p>　　圖5 地表植物對(duì)于土壤微生物群的代謝平均度的影響</p><p>　　一個(gè)長(zhǎng)期爭(zhēng)論的問(wèn)題是：多樣性是否與生產(chǎn)力相關(guān)，特別是植物產(chǎn)量。CLPP方法得出的數(shù)據(jù)經(jīng)常被用于表示土壤功能多樣性。Yan等發(fā)現(xiàn)有機(jī)C和功能多樣性之間存在一個(gè)斷棍的關(guān)系，并且他們也重新計(jì)算了Sha

31、rma等給出的數(shù)據(jù)，該作者曾經(jīng)說(shuō)發(fā)現(xiàn)了H’和微生物生物量之間存在線性關(guān)系。在那種情況下，斷棍模型給出了最好的解釋（圖6）。</p><p>　　圖6 到了某個(gè)頂點(diǎn)，功能多樣性（H’）隨著土壤中微生物量和/或有機(jī)C的增加而</p><p>　　單調(diào)遞增。數(shù)據(jù)來(lái)自Yan等（2000，圓圈）和Sharma等（1997，黑點(diǎn)）</p><p>　　從這些數(shù)據(jù)可以看出，在某一

32、特定的臨界值以前（例如1.7%有機(jī)C），功能多樣性隨土壤微生物生物量單調(diào)遞增。</p><p>　　4檢測(cè)微生物多樣性的分子生物學(xué)方法</p><p>　　土壤微生物多樣性通常都是由像可行的培養(yǎng)方法、CLPP和流式細(xì)胞儀等這些方法來(lái)分析。這些方法有很多的不足。一個(gè)強(qiáng)有力的證據(jù)就是當(dāng)在顯微鏡下觀察土壤細(xì)菌時(shí)，看到的大部分是活的，但是在瓊脂平板上卻不能形成可見(jiàn)的菌落。但是，取自環(huán)境中的樣品無(wú)論

33、是可培養(yǎng)的還是不可培養(yǎng)的微生物都可以用基于提取、純化和核苷酸特性的分子技術(shù)來(lái)鑒定。這些技術(shù)提供了一種更加精確的土壤微生物多樣性程度衡量方法。這些微生物核苷酸信息可以用來(lái)觀察和比較不同系統(tǒng)水平的多樣性，從物種變化到群落多樣性都可以。這一部分綜述了現(xiàn)在研究土壤微生物群落的一些分子學(xué)方法的潛力和缺陷。為了說(shuō)明分子方法的有效性和簡(jiǎn)便性，文章中給出了它們?cè)谘芯勘镜赜嘘P(guān)受污染和干擾的土壤微生物群落的一些具體應(yīng)用的例子（圖7）。</p>

34、<p>　　圖7 縱覽分析微生物群落的非培養(yǎng)的分子生物方法。PCR聚合鏈反應(yīng)，DGGE變性梯度凝膠電泳，SSCP</p><p>　　單鏈構(gòu)象多態(tài)性，T-RFLP末端限制性片段電泳，RISA基因間隔區(qū)分析，%G+C摩爾%鳥嘌呤+胞嘧啶</p><p>　　從微生物群落獲得的總基因組DNA（元基因組）可以提供全部群落結(jié)構(gòu)和總遺傳多樣性的補(bǔ)充信息。例如，細(xì)菌人工染色體載體可以用來(lái)直

35、接從土壤微生物群落中克隆大片段的DNA。通過(guò)高和低的分辨率，細(xì)菌人工染色體文庫(kù)可以用來(lái)在系統(tǒng)發(fā)生和功能水平上研究土壤微生物多樣性。</p><p>　　中等分辨率的方法包括系統(tǒng)發(fā)育探針的應(yīng)用，或者是群落DNA或者RNA的空位或者點(diǎn)墨法雜交，或者是完整的細(xì)胞熒光原位雜交。這些方法可以用來(lái)確定目標(biāo)微生物的數(shù)量和測(cè)定微生物群落的全部的分類學(xué)組成。</p><p>　　其他的中等分辨率的方法是基于

36、保守基因的序列差異，例如編碼的核糖體RNA、所謂的rDNA。這些指紋識(shí)別方法相同的地方是都使用了PCR來(lái)特異擴(kuò)增目標(biāo)核苷酸。擴(kuò)增的結(jié)果或者用來(lái)限制性分析或者基于變性或構(gòu)象性質(zhì)進(jìn)行分離。rRNA或者rDNA的限制性分析[擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析（ARDRA）；末端限制性片段電泳（T-RFLP）]可以在高水平的分類學(xué)等級(jí)進(jìn)行區(qū)分，甚至可以鑒別到種。Osborn等曾發(fā)現(xiàn)rRNA的基因的T-RFLP的峰可以用來(lái)區(qū)分鞘氨醇單胞菌屬的物種。他們認(rèn)

37、為，從整個(gè)群落和（或）分離的或克隆得到的峰通過(guò)與預(yù)先存儲(chǔ)的T-RF片段的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，可以直接鑒定峰中的某些片段在分類學(xué)中的位置。T-RFLP和群落指紋印跡技術(shù)[變性/溫度梯度凝膠電泳（DGGE/TGGE）；單鏈結(jié)構(gòu)多態(tài)性（SSCP）]，這些基于分離PCR擴(kuò)增的rRNA和rDNA分子的技術(shù)已經(jīng)被成功的用來(lái)分析微生物群落的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。</p><p>　　高等分辨率的方法包括非編碼DNA區(qū)域的指紋識(shí)別（例如re

38、p-PCR-擴(kuò)增重復(fù)性序列）和編碼區(qū)及非編碼區(qū)的測(cè)序。這些方法適合于在種和亞種的水平上區(qū)別和鑒定微生物菌株。高分辨率的指紋識(shí)別方法也已經(jīng)被用于監(jiān)測(cè)微生物群落的特殊種群和評(píng)估細(xì)菌群體和克隆基因的多樣性。</p><p>　　5用總基因組DNA方法來(lái)分析生物多樣性</p><p>　　土壤微生物群落的組成情況可以通過(guò)檢測(cè)群落DNA的堿基差異[摩爾%鳥嘌呤+胞嘧啶（%G+C）]來(lái)獲得。這個(gè)由熱變

39、性即可測(cè)定，因?yàn)閱捂淒NA比雙鏈DNA在260nm的吸光能力大概高35%。用一個(gè)恒溫的試管在慢慢加熱的條件下,通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260nm處的吸光度來(lái)檢測(cè)DNA的解鏈。解鏈曲線轉(zhuǎn)化成%G+C的峰，以此來(lái)提供微生物群落的峰，從而能夠指示整個(gè)的遺傳多樣性。即使這種方法被認(rèn)為分辨率很低，但是它可以用來(lái)指示整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)的整個(gè)變化，尤其是多樣性很低的情況。DNA堿基組成曲線圖也可以通過(guò)笨亞甲胺-DNA復(fù)合物在氯化銫梯度下等密度梯度離心來(lái)

40、獲得。雙苯酰亞胺優(yōu)先與A-T堿基對(duì)結(jié)合，這會(huì)使DNA的浮力密度降低。因此，根據(jù)堿基組成通過(guò)雙苯酰亞胺密度梯度離心可以將群落DNA分離開(kāi)來(lái)。這種方法有一個(gè)缺陷,就是兩個(gè)具有相似堿基差異的群落不一定有相似的物種組成，這是因?yàn)椴煌奈锓N經(jīng)常有相似的堿基組成。從另外一方面來(lái)說(shuō)，如果群落之間有不同的堿基差異，這可以有力的說(shuō)明它們之間物種組成是不同的。因此，這個(gè)方法可以用來(lái)大致的反應(yīng)干擾條件下微生物群落組成的變化。雙苯酰亞胺-氯化銫梯度超離心分離得

41、到的群落D</p><p>　　從微生物群落分離出來(lái)的DNA復(fù)雜性是對(duì)總遺傳多樣性的一個(gè)估計(jì)。當(dāng)在低于其解鏈點(diǎn)溫度大概25℃時(shí)單鏈DNA再退火，變性的比率就指示這個(gè)遺傳復(fù)雜性。隨著DNA復(fù)雜性的提高或者溶液中不同DNA型的數(shù)量，變性比率會(huì)下降。重聯(lián)的DNA部分可以通過(guò)C0t值來(lái)反映，其中C0是指摩爾核苷酸每升，t是指以秒計(jì)算的時(shí)間。C0t1/2（50%DNA重聯(lián)時(shí)）用來(lái)估計(jì)DNA的復(fù)雜性。圖8給出了一個(gè)適于耕種

42、土壤中微生境群落DNA的C0t曲線的例子。土壤微生境或者是埋于甲烷氣體環(huán)境下以此為C源（CH），或者是在厭氧條件下（N2）。用未處理的天然土壤作為對(duì)照。由于復(fù)雜性已知[4.1×106堿基對(duì)（bp）]，E.coli B基因組DNA的重聯(lián)速率作為標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1）。為了估計(jì)土壤群落DNA的大小，使群落DNA的C0t1/2除以E.coli B基因組DNA的C0t1/2，然后再乘以E.coli B基因組的大小。</p>&

43、lt;p>　　重連結(jié)果顯示干擾減少了微生物多樣性（圖8，表2）。未受干擾的土壤DNA其C0t1/2值是6300摩爾每秒每升，相當(dāng)于大約8000個(gè)不同的大腸桿菌基因組。氮?dú)夂图淄橛绊懙耐寥繢NA的C0t1/2值分別減少到了2500摩爾每秒每升和300摩爾每秒每升。這分別相當(dāng)于3200和340個(gè)不同的大腸桿菌基因組。</p><p>　　當(dāng)應(yīng)用于微生物群落DNA時(shí)，C0t1/2值被用作遺傳多樣性的一個(gè)參數(shù)，它包

44、含了群落總的遺傳信息（豐富度成分）和不同遺傳型之間的差異信息（均勻度成分）。這使得兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)的群落可能具有一致的C0t1/2值。</p><p>　　圖8 大腸桿菌的DNA的重新組合（C0t，其中C0代表摩爾核苷酸每升，t代表時(shí)間/秒），或未處理土壤中的細(xì)菌部分（K），厭氧條件下的土壤（N2）和CH4作為主要碳源的土壤（CH）（Øvreås等，1998）</p><p&g

45、t;　　表1 土壤微生物多樣性研究的分子學(xué)方法</p><p>　　注：G+C鳥嘌呤+胞嘧啶，PCR聚合鏈反應(yīng)，DGGE變性梯度凝膠電泳，TGGE溫度梯度凝膠電泳，SSCP單鏈構(gòu)象多態(tài)性，T-RFLP末端限制性片段電泳，ARDRA擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析，RISA基因間隔區(qū)分析，F(xiàn)ISH熒光原位雜交</p><p>　　表2 在6倍檸檬酸鹽、30%二甲亞砜中計(jì)算得出的微生物群落遺傳多樣性

46、重新組合動(dòng)力學(xué)</p><p>　　注：土壤群落DNA大小用堿基對(duì)（bp），相等的大腸桿菌基因組（E.coli基因組大?。?.1×106bp）（(Brønstad等. 1996; Drønen等. 1998）。C0代表摩爾核苷酸每升，t代表時(shí)間/秒</p><p>　　為了估計(jì)原核生物的多樣性，DNA必須高度純化并且與真核生物的DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)。因此，必須使用一

47、種間接地DNA提取方法將土壤中的細(xì)菌分離開(kāi)，即在細(xì)胞溶解之前進(jìn)行分級(jí)離心。另外，為了更加精確地估計(jì)高純度的DNA，必須使用統(tǒng)一的片段長(zhǎng)度。從土壤微生物群落中提取的DNA通常很復(fù)雜，重聯(lián)率也很低，但是如果在檸檬酸鹽溶液和30%DMSO中測(cè)量時(shí)它將會(huì)提高。然而，為了更好的估計(jì)C0t1/2值需要重復(fù)多次以達(dá)到50%的重聯(lián)率。</p><p>　　大片段的土壤群落DNA（100kb）不用PCR擴(kuò)增就可以直接克隆進(jìn)BAC載

48、體。從F-質(zhì)粒獲得的BAC載體可以在大腸桿菌宿主內(nèi)穩(wěn)定地保存大的插入序列。在理論上，BAC文庫(kù)可以容納全部的微生物群落基因組，并且可以用來(lái)繪制基因組圖譜、篩選特殊物種、評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育分析和功能多樣性。這可以通過(guò)與特殊探針進(jìn)行雜交、遺傳指紋識(shí)別和測(cè)序來(lái)實(shí)現(xiàn)。這種方法的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是不要通過(guò)PCR擴(kuò)增，因而避免了許多其他指紋識(shí)別和測(cè)序技術(shù)中這一步驟的缺陷。每一個(gè)BAC克隆代表一個(gè)元基因組片段，它可能包含具有它們自己?jiǎn)?dòng)子的基因和操縱子，從而能夠使

49、它們?cè)诖竽c桿菌宿主中表達(dá)。所以，土壤微生物系統(tǒng)發(fā)育和功能之間的關(guān)聯(lián)信息可以通過(guò)克隆體的結(jié)合研究來(lái)隱藏rRNA，功能性的基因則可以通過(guò)克隆和雜交來(lái)獲得。</p><p>　　核糖體RNA基因（rDNA）以及它們的轉(zhuǎn)錄片段和rRNA分子是分類鑒定和衡量微生物遺傳多樣性最常用的標(biāo)記物。基于rRNA的方法已經(jīng)顯示了原核微生物中高度發(fā)散的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系，它代表了地球上絕大多數(shù)的遺傳多樣性。這種非培養(yǎng)的rRNA方法揭示了新的血

50、統(tǒng)，在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)角度不同于培養(yǎng)方法和特征性的土壤探針。他們表明來(lái)自相似棲息環(huán)境不同地理區(qū)域的微生物有相關(guān)性，但是具有相同官能團(tuán)的微生物可能屬于不同的系統(tǒng)發(fā)生組（親緣型），這反映了生態(tài)位的不同。Tiedje等質(zhì)疑微生物是世界性的這個(gè)假說(shuō)，他們發(fā)現(xiàn)每一相同大陸區(qū)域每一個(gè)取樣點(diǎn)微生物的基因型都是特異性的。</p><p>　　6土壤微生物群落的遺傳指紋圖譜和通過(guò)比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列來(lái)鑒定群落成員</p&

51、gt;<p>　　基于PCR擴(kuò)增的遺傳指紋圖譜方法在分離擴(kuò)增物方法有很多不同的方法。像末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，這樣的新方法使用熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增物，然后通過(guò)在自動(dòng)測(cè)序系統(tǒng)中使用激光檢測(cè)熒光DNA片段來(lái)分離PCR產(chǎn)物?；赑CR的群落指紋圖譜技術(shù)有許多的優(yōu)點(diǎn)，包括：快速，可以平行分析大量的樣品；可靠，高度的可重復(fù)性；提供一個(gè)群落里的種群的性質(zhì)和數(shù)量上的信息；可以通過(guò)比較片段大小或者數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列來(lái)評(píng)價(jià)群落成員之間的系統(tǒng)發(fā)育

52、關(guān)系。但是，基于PCR的技術(shù)也有很多的缺陷，例如：由于優(yōu)先擴(kuò)增某些細(xì)菌的目標(biāo)DNA序列而導(dǎo)致的PCR擴(kuò)增差異；形成嵌合分子；由于許多的操縱子的存在導(dǎo)致從一株細(xì)菌獲得許多不同的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；復(fù)雜群落的擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量太多以至于很難分離和分析。</p><p>　　用DGGE和TGGE的方法PCR-擴(kuò)增rDNA的DNA指紋圖譜可以提供群落組成的信息。在DGGE/TGGE方法中，相同長(zhǎng)度但是不同核苷酸序列的DNA片段被分

53、離。這種分離是基于在一個(gè)線性變性梯度聚丙烯酰胺凝膠中PCR擴(kuò)增的DNA分子具有不同的遷移率。DGGE依靠變性物質(zhì)（尿素和甲酰胺）的濃度梯度，而TGGE卻基于溫度梯度。具有不同序列的DNA分子在熔解時(shí)將會(huì)產(chǎn)生差異。隨著DNA分子在變性凝膠中遷移，它們開(kāi)始在特定的熔解區(qū)熔解，因此它們開(kāi)始變成部分單鏈。部分變性的或者全部變性的分子停止在凝膠中遷移，DNA片段由于不同的堿基組成和序列而在凝膠上占據(jù)不同的位置。使用可以與可變區(qū)附近的保守區(qū)退火的引

54、物，對(duì)微生物群落DNA中的rDNA的可變區(qū)（230-500bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。前面的引物與富含G+C的序列（GC夾子，通常達(dá)40bp長(zhǎng)度）相共價(jià)連接以阻止雙鏈全部解鏈。這種技術(shù)的一個(gè)不足就是不同生物的16SrDNA能夠在變性凝膠上形成一條特定的條帶。但是，當(dāng)應(yīng)用于不是很復(fù)雜的群落時(shí)，就可以假設(shè)通過(guò)DGGE/TGGE獲得的可辨別的條帶代表群落中的大量的優(yōu)勢(shì)微生物種群。群落的分類學(xué)組成信息可以通過(guò)凝膠印</p><p&

55、gt;　　DGGE/TGGE方法分析從反轉(zhuǎn)錄PCR的rRNA分子獲得的PCR擴(kuò)增物或許可以得出代謝活躍的微生物種群的指紋圖譜。DGGE/TGGE在快速篩選大量樣本以區(qū)分土壤微生物群落時(shí)很有效。它們?cè)谡{(diào)查微生物群落空間和時(shí)間的差異時(shí)很方便，可以提供優(yōu)勢(shì)菌群的變化信息。</p><p>　　SSCP，像DGGE/TGGE一樣，可以檢測(cè)從rDNA可變區(qū)獲得的不同PCR擴(kuò)增物的序列變化。在SSCP中，一個(gè)引物是在5’端磷

56、酸化的，并且擴(kuò)增物中磷酸化的鏈被λ核酸外切酶選擇性的酶切。完整的鏈通過(guò)在非變性條件下（低溫）優(yōu)化的SSCP聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離。這種優(yōu)化的凝膠限制雙鏈但是允許DNA鏈的分子內(nèi)部折疊。這種方法是基于單鏈DNA的不同分子內(nèi)折疊，其本身取決于DNA序列的變化。因此，DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)改變了單鏈PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳遷移速率，從而使其被分辨出來(lái)。這種方法的可重復(fù)性和辨別能力取決于片段的大小和片段內(nèi)序列變化的位置，通常片段小于400bp效果最理想。

57、SSCP已經(jīng)被用于區(qū)別純培養(yǎng)的土壤微生物和不同植物不可培養(yǎng)的根圍微生物群落的群落指紋圖譜。SSCP方法原則上比DGGE/TGGE方法要容易操作，因?yàn)樗恍枰獛C夾子的引物和梯度凝膠所需要的特殊儀器。除了PCR本身存在的誤差以外，這種方法的一個(gè)不足就是某一單個(gè)細(xì)菌物種可能產(chǎn)生許多條帶，因?yàn)樵S多操縱子的存在或者單鏈PCR擴(kuò)增物有很多個(gè)構(gòu)象。</p><p>　　T-RFLP方法是基于對(duì)末端熒光標(biāo)記的PCR擴(kuò)增物進(jìn)行

58、限制性核酸內(nèi)切酶酶切的一種方法。這些PCR擴(kuò)增物通過(guò)使用引物連接到rRNA基因可變區(qū)附近的一致性序列而從微生物群落DNA獲得。兩個(gè)引物通常都是使用熒光亞磷酰胺染料標(biāo)記5’末端。然后擴(kuò)增物通過(guò)限制性酶切再進(jìn)行凝膠或者毛細(xì)管凝膠電泳分離。熒光標(biāo)記的片段可以在自動(dòng)分析儀里通過(guò)熒光檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，因此，這種技術(shù)只檢測(cè)末端標(biāo)記的限制性片段。所以，T-RFLP結(jié)合了PCR、RFLP和凝膠電泳三種技術(shù)。通過(guò)使用計(jì)算機(jī)程序在數(shù)據(jù)庫(kù)中在16SrDNA序列

59、上確定恰當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)，不同的限制性酶切出的rRNA的T-RF片段大小差異可以預(yù)測(cè)出來(lái)，實(shí)驗(yàn)獲得的PCR擴(kuò)增物的T-RF峰或者從群落DNA獲得的16SrDNA克隆文庫(kù)可以與預(yù)測(cè)的T-RF峰或者系統(tǒng)發(fā)育分類進(jìn)行比較。這些分析方法已經(jīng)被用來(lái)區(qū)分群落和研究土壤中的群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)。除了基于持家基因（例如rDNA）的分析，T-RFLP也被用來(lái)分析像汞抗性基因這樣的功能基因以及微粒的甲烷單加氧酶基因。</p><p>

60、　　ARDRA是在細(xì)菌鑒定和物種水平分類方面強(qiáng)有力的一個(gè)工具，它已經(jīng)被用來(lái)分類大批的分離株和克隆物。在PCR過(guò)程中通過(guò)加入熒光標(biāo)記的dUTP獲得的熒光PCR擴(kuò)增物可以直接進(jìn)行自動(dòng)的ARDRA。限制性酶切得到的片段通過(guò)自動(dòng)DNA測(cè)序凝膠分離。然后，酶切樣品數(shù)據(jù)與使用數(shù)據(jù)庫(kù)序列獲得的已知細(xì)菌的rDNA限制性分析進(jìn)行比較。</p><p>　　RISA是基于16S和23S rRNA基因之間核糖體基因間隔區(qū)的長(zhǎng)度多態(tài)性，

61、這個(gè)間隔區(qū)的長(zhǎng)度具有菌株或者物種特異性，通常在50bp到1500bp之間。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離。即使很相近的菌株，核糖體的非編碼間隔區(qū)大小和核苷酸序列都存在變化。這種方法成功地被用來(lái)分類菌株和指紋鑒定簡(jiǎn)單的群落和混合的種群。RISA的自動(dòng)版本，叫做ARISA，它使用熒光標(biāo)記前端引物來(lái)PCR擴(kuò)增內(nèi)部間隔區(qū)。然后片段進(jìn)行毛細(xì)管電泳，根據(jù)大小自動(dòng)分離，它們的大小可以與DNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的進(jìn)行比較。同時(shí)使用許多引物靶標(biāo)相同樣品中的不

62、同的系統(tǒng)發(fā)生基團(tuán)可以評(píng)估一個(gè)群落中的不同微生物種型的種群動(dòng)力學(xué)。</p><p>　　當(dāng)大量的PCR擴(kuò)增物相似性太高以致于不容易分辨時(shí)，遺傳指紋圖譜方法在區(qū)分高度多樣性的群落時(shí)就有局限。在復(fù)雜的群落中，針對(duì)群落的一部分使用引物靶標(biāo)特殊基因（例如古生菌）或者微生物的功能性基團(tuán)（產(chǎn)甲烷的），可以利用基于rRNA的指紋圖譜技術(shù)來(lái)部分的分析群落。根據(jù)Gomes等報(bào)道，區(qū)分不同的細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育群體可以使用以下引物：F984G

63、C,F27,R1378和R1494（細(xì)菌）和F243HGC（放線菌），F(xiàn)203α（α-變形菌）和F948β（β-變形菌）。特殊引物也適用于檢測(cè)特殊基因，例如類芽孢桿菌，布克氏菌和桿菌。評(píng)估真菌多樣性一直是一個(gè)問(wèn)題，因?yàn)槭褂玫囊锟梢酝瑫r(shí)擴(kuò)增其他真核生物的DNA，例如植物、水藻和線蟲類的。由Vainio和Hantula發(fā)現(xiàn)的真菌引物已經(jīng)被成功的用于研究熱帶玉米的田間和根圍土壤的真菌群落多樣性。</p><p>　　

64、另外一個(gè)鑒定群落成員的方法就是應(yīng)用特別的富集培養(yǎng)基以加快感興趣的微生物的生長(zhǎng)。這種方法在研究功能性群體方面特別有效。</p><p><b>　　雜交技術(shù)</b></p><p>　　該方法是設(shè)計(jì)出與16S rRNA或者23S rRNA序列相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育寡核苷酸探針，然后用來(lái)和rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。探針的特異性取決于目標(biāo)序列的變化。通過(guò)選擇rRNA的保守的、

65、可變的和超變區(qū)序列，探針可以標(biāo)記從域到亞種的不同分類水平的系統(tǒng)發(fā)育基團(tuán)。土壤微生物群落主要親緣型的相對(duì)豐度可以用群落DNA數(shù)量點(diǎn)墨雜交或者通過(guò)基團(tuán)特異性系統(tǒng)發(fā)育探針進(jìn)行FISH（熒光原位雜交）。在熒光原位雜交方法中，系統(tǒng)發(fā)育探針被用熒光染料標(biāo)記然后用來(lái)做環(huán)境樣品的單細(xì)胞的原位檢測(cè)（整個(gè)細(xì)胞雜交）。Amann和Wagner等提供了關(guān)于這方面的步驟和方法學(xué)的出色綜述。在probeBase網(wǎng)站可以找到合適的熒光原位雜交的探針（http://w

66、ww.microbial-ecology.net/probebase/）。</p><p>　　雜交方法可以幫助分辨群落中特殊部分（如有機(jī)群體）的物種組成。已經(jīng)證實(shí)，通過(guò)使用系統(tǒng)發(fā)育探針，群落指紋圖譜的點(diǎn)跡和Southern印跡雜交在研究群落變化和鑒定大量的優(yōu)勢(shì)群落成員時(shí)很有效。點(diǎn)墨雜交和熒光原位雜交已經(jīng)被聯(lián)合用于區(qū)分不同程度的金屬污染的土壤群落結(jié)構(gòu)。</p><p>　　在熒光原位雜交技

67、術(shù)中，使用落攝式熒光顯微鏡即可看到被標(biāo)記的微生物。標(biāo)準(zhǔn)的熒光原位雜交方法存在一些缺陷，在敏感度方面它不能檢測(cè)出低核糖體含量的細(xì)胞。每個(gè)細(xì)胞的低生理活性往往與低核糖體含量有關(guān)，因此，低生長(zhǎng)率或者餓死的細(xì)胞就有可能檢測(cè)不出來(lái)。為了克服這個(gè)缺陷，人們采用了一種酪胺信號(hào)放大技術(shù)用于FISH，該技術(shù)可以分析緩慢生長(zhǎng)的微生物。</p><p>　　FISH已經(jīng)被用于鑒定不可培養(yǎng)的微生物，研究微生物群落的分布和數(shù)量。一系列不同

68、系統(tǒng)發(fā)育探針雜交后在顯微鏡下計(jì)數(shù)，可以確定體統(tǒng)發(fā)育群體的數(shù)量和分類學(xué)上的個(gè)體的相對(duì)分布。</p><p>　　克隆rRNA基因分析</p><p>　　克隆技術(shù)可以替代指紋圖譜方法來(lái)分析PCR擴(kuò)增物，并且已經(jīng)被廣泛的用來(lái)分析微生物群落。從環(huán)境中獲得的DNA通過(guò)克隆載體由PCR擴(kuò)增rRNA基因得到克隆文庫(kù)。細(xì)菌、真菌和古生菌的rRNA基因通過(guò)使用區(qū)域特異性和廣泛的引物已經(jīng)被獨(dú)立的PCR反應(yīng)擴(kuò)

69、增出來(lái)?？寺〉臄U(kuò)增子可以與指紋圖譜方法的進(jìn)行比較（如ARDRA）。然后通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育探針點(diǎn)墨印跡雜交鑒定這些克隆。對(duì)這些克隆的rRNA基因進(jìn)行測(cè)序，然后與數(shù)據(jù)庫(kù)中的進(jìn)行比較可以得出克隆序列之間的聯(lián)系。</p><p>　　7使用分子學(xué)方法在不同水平上評(píng)估農(nóng)業(yè)管理和污染對(duì)于土壤微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響</p><p>　　不同的農(nóng)業(yè)管理和重金屬污染的土壤都使用群落結(jié)構(gòu)的多樣性和變化作為干擾

70、和污染的生態(tài)指標(biāo)。</p><p>　　有上述相關(guān)技術(shù)得出的適于耕種（如谷物、蔬菜和馬鈴薯）的土壤微生物多樣性可以與有機(jī)土壤相比較，在過(guò)去的十年中單獨(dú)使用牧場(chǎng)地。這兩種土壤有相似的質(zhì)地（砂壤土），并且坐落于挪威西部400米遠(yuǎn)。重新組合的技術(shù)顯示，根據(jù)C0t1/2值計(jì)算，微生物群落DNA的復(fù)雜性在適于耕種的土壤中大概是1.4×109bp，有機(jī)土壤中大概是3.3×1010bp。這在適于耕種土壤和有

71、機(jī)土里面分別相當(dāng)于大約340和8000個(gè)不同的大腸桿菌基因組大?。?.1×106bp）的遺傳多樣性。由此可見(jiàn)，耕種土壤的總遺傳多樣性大概比相對(duì)沒(méi)有受干擾的土壤低24倍，并且整個(gè)的遺傳多樣性提供了一個(gè)很好的由農(nóng)業(yè)管理引起的干擾指標(biāo)。PCR聯(lián)合DGGE顯示，這兩種土壤中的不同細(xì)菌類型的數(shù)量很高，這意味著這兩種土壤多樣性物種豐度很高。由于含有一定數(shù)量的優(yōu)勢(shì)菌群和并且許多只是低豐度，耕種土壤的菌群可能要比牧地土壤的分布更加不均勻。這將

72、導(dǎo)致很低的平均度，因此與牧地土壤相比耕種土壤的遺傳多樣性也很低。</p><p>　　由各種技術(shù)得出的無(wú)污染的污泥改良的土壤微生物多樣性與（低和高的金屬濃度）金屬污染許多年的污泥處理的田間土壤比較，一方面，這三種處理得出的堿基組成很相似；另一方面，由DNA:DNA重聯(lián)檢測(cè)出的總遺傳多樣性是不同的。沒(méi)有污染的土壤群落的DNA復(fù)雜度是4.0×1010bp。這相當(dāng)于大約9800個(gè)具有大腸桿菌基因組大小的不同細(xì)

73、菌基因組。金屬污染的土壤多樣性減少，并且與污染的程度有關(guān)。低濃度和高濃度的金屬污染的土壤DNA豐富度分別是1.9×1010bp和6.2×109bp，分別相當(dāng)于大約4600個(gè)和1500個(gè)像大腸桿菌一樣的基因組。</p><p>　　低和高金屬污染的土壤群落結(jié)構(gòu)是用基團(tuán)特異性系統(tǒng)發(fā)育探針進(jìn)行雜交得出的，包括α-變形菌（ALF1b）、β-變形菌（GAM42a）、δ-變形菌（SRB385）、嗜纖維素菌

74、-屈撓桿菌-似細(xì)菌（CF319a）、低mole%（G+C）的革蘭氏陽(yáng)性菌和高mole%（G+C）的革蘭氏陽(yáng)性菌。這些探針適用于總細(xì)菌群落（FISH），細(xì)菌單體和基于PCR的16S rRNA克隆文庫(kù)（空位印跡雜交）。對(duì)大約300個(gè)克隆和300個(gè)細(xì)菌群體一起進(jìn)行分析顯示，非培養(yǎng)方法（FISH和克隆分析）得出相似的結(jié)果，然而培養(yǎng)方法（孤立分析）卻顯示群落組成有很大的不同。低金屬污染的土壤中嗜纖維素菌-屈撓桿菌-似細(xì)菌群體數(shù)量最為豐富。這個(gè)群體

75、在低金屬污染的土壤中的豐富度是高金屬污染土壤的兩倍。在重度金屬污染土壤中，α-變形菌的克隆在數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)（圖9）。關(guān)于孤立群，30-37%屬于低mole%G+C的革蘭氏陽(yáng)性菌。因此，這是兩種土壤中最大的孤立群體。在重度金屬污染的土壤中孤立群的數(shù)量和α-變形菌亞綱的克隆變化明顯，克隆數(shù)比例是38%，孤立群僅只有14%。</p><p>　　這些調(diào)查顯示，在相對(duì)干擾和污染較少的土壤中的總微生物多樣性很高，然而經(jīng)過(guò)干

76、擾和污染的土壤中的總微生物多樣性卻劇烈的減少。微生境調(diào)查顯示一些種群類型在壓力條件下會(huì)變?yōu)閮?yōu)勢(shì)群體。污染會(huì)導(dǎo)致土壤群落結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈的變化。結(jié)果顯示大量的微生物多樣性檢測(cè)和群落結(jié)構(gòu)分析方法可以區(qū)別不同程度污染的土壤，可以成為壓力和干擾的有效指標(biāo)。</p><p>　　圖9 低濃度和高濃度金屬污染的污泥土壤群落結(jié)構(gòu)變化。</p><p>　　全部細(xì)胞熒光原位雜交使用了屬特異性的16S和23Sr

77、RNA系統(tǒng)發(fā)育探針，PCR擴(kuò)增的土壤中的總16S和23SrDNA的300個(gè)克隆用點(diǎn)墨雜交。沒(méi)有污染的空白對(duì)照土壤也用熒光原位雜交測(cè)定。使用與以下系統(tǒng)發(fā)育屬的細(xì)菌相異的探針：α-變形菌（ALF1b）、β-變形菌（GAM42a）、δ-變形菌（SRB385）、嗜纖維素菌-屈撓桿菌-似細(xì)菌（CF319a）、低mole%（G+C）的革蘭氏陽(yáng)性菌和高mole%（G+C）的革蘭氏陽(yáng)性菌。對(duì)于縮寫，見(jiàn)圖7</p><p>　　8

78、轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)微生物群落的影響</p><p>　　微生物接種菌在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中已經(jīng)應(yīng)用超過(guò)每年3億公頃，其中的一些有歷史安全使用記錄的始于1896年（知名的根瘤菌，用來(lái)接種豆科植物）或者19世紀(jì)30年代（例如蘇云金芽孢桿菌，用來(lái)生物防治無(wú)脊椎害蟲）。其中大多數(shù)的接種菌都由根瘤菌組成，其他的應(yīng)用有接種水稻Azolla-Anabaena、谷類作物或者牧草接種azospirilli（主要有高粱、玉米、小麥）、大量樹木接種

79、菌根真菌（例如柑橘、櫟樹、柳樹、椴樹、榛樹、楊樹、玉米、洋蔥等）和桿菌、假單胞菌和木霉的物種用作生防制劑（例如植物保護(hù)劑抗病原菌，主要是真菌）。其他的微生物制劑有應(yīng)用潛力的現(xiàn)在主要有生物修復(fù)和植物修復(fù)、磷酸鹽增溶、土壤集聚、污物處理、生物浸取、油恢復(fù)、煤炭擦洗和生產(chǎn)生物氣體。至今研究最多的轉(zhuǎn)基因微生物制劑有根瘤菌屬、假單胞菌屬和固氮螺菌屬，這些細(xì)菌已經(jīng)被用來(lái)在田間規(guī)模做種子保護(hù)劑以測(cè)試其效果，也以此深入的研究其試用的安全相關(guān)的方面，例如

80、它們?cè)谕寥拉h(huán)境中的命運(yùn)。</p><p>　　熒光假單胞桿菌SBW25，分離自甜菜葉面，很容易定植于甜菜的根圍、葉面和小麥的根圍。標(biāo)記基因（lacZY和kanrxylE）被選作標(biāo)記以減少簡(jiǎn)單培養(yǎng)方法鑒定和檢測(cè)轉(zhuǎn)基因微生物的困難，它定位于6.5Mb染色體的1Mb處以確保遺傳型和表型的穩(wěn)定，并且使與此兩種谷物相關(guān)的微生物種群的任何基因改變變得容易。結(jié)果顯示沒(méi)有標(biāo)記基因的運(yùn)動(dòng)，對(duì)于原來(lái)的群落只有小的瞬間的影響。隨后，D

81、e Leij等作了研究，使用標(biāo)記基因改造菌株后釋放進(jìn)田間，調(diào)查插入基因?qū)Ω鞣N組成成分生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)力潛在的代謝壓力。但是卡那霉素抗性不影響生物適應(yīng)性，其他的兩種標(biāo)記則減少了生態(tài)競(jìng)爭(zhēng)力。因此，雖然轉(zhuǎn)基因細(xì)菌在田間具有競(jìng)爭(zhēng)力，但是野生型的卻具有更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)力。</p><p>　　就功能基因而言，分離自甜菜的熒光假單胞桿菌F113菌株能產(chǎn)生抗生素DAPG。除了能防治腐酶屬引起的枯萎病以外，它也能有效地防治馬鈴薯軟腐病病原菌胡

82、蘿卜軟腐歐文氏菌亞種和馬鈴薯金線蟲。為了作比較，把菌株F113G22進(jìn)行改造以產(chǎn)生Tn5::lacZY 不產(chǎn)生DAPG的衍生的F133，此菌株沒(méi)有阻止植物病原菌真菌生長(zhǎng)的能力。這個(gè)構(gòu)建的和原來(lái)的種群被用來(lái)研究熒光假單胞桿菌對(duì)土壤微生物群的影響。其中使用的一個(gè)主要方法是檢測(cè)加入構(gòu)建的和原來(lái)的細(xì)菌群以后對(duì)根圍、土壤酶N-乙酰氨基葡糖苷酶、果膠酶、酸和堿性磷酸酶、磷酸二酯酶、芳基硫酸酯酶和尿酶，這些酶在土壤的C、N、P和S的循環(huán)中起著重要的作

83、用。在任何土壤變動(dòng)下，轉(zhuǎn)基因標(biāo)記沒(méi)有影響任何的土壤酶活性（卡那霉素中加入乳糖）。</p><p>　　然而，關(guān)于接種轉(zhuǎn)基因微生物的影響并沒(méi)有直接涉及微生物多樣性的問(wèn)題，大多數(shù)集中于其他風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面的，例如它們?cè)诃h(huán)境中的抵抗力和根圍的定植能力。當(dāng)將惡臭假單孢菌WCS358r和獨(dú)立的產(chǎn)吩嗪-1-羧酸（抗菌復(fù)合物）轉(zhuǎn)基因微生物WCS358r::phr處理種子后，通過(guò)重復(fù)ARDRA產(chǎn)峰集中分析，小麥根部的真菌種群發(fā)生變化

84、。當(dāng)引入的細(xì)菌數(shù)量相對(duì)較高時(shí)，主要的影響發(fā)生在田間試驗(yàn)的初期；轉(zhuǎn)基因微生物對(duì)真菌種群的組成比WCS358r的影響時(shí)間要持久。</p><p>　　微生物制劑的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)不同的國(guó)家都不一樣。為了保護(hù)農(nóng)民和更加容易的控制或者國(guó)際機(jī)構(gòu)或相關(guān)當(dāng)局監(jiān)測(cè)，有一個(gè)確定一致的國(guó)際性的立法將會(huì)很有益的。包括歐盟至今都沒(méi)有一個(gè)立法機(jī)構(gòu)。</p><p>　　在過(guò)去的二十年中，科學(xué)知識(shí)有了長(zhǎng)足的進(jìn)步，可以更加精確

85、地跟蹤環(huán)境中的微生物并且可以在物種和菌株水平進(jìn)行鑒定。這些可以通過(guò)一系列的常規(guī)的工具和先進(jìn)的分子技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)，這在其他的章節(jié)已有敘述。</p><p>　　9轉(zhuǎn)基因植物對(duì)微生物群落的影響</p><p>　　過(guò)去的十年中人們使用了大量的轉(zhuǎn)基因植物，并且許多轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)被商品化。但是，關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于土壤微生物群落的潛在影響卻鮮有研究報(bào)道。是不是人們覺(jué)得轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物種群的影響可以

86、忽略，或者說(shuō)至少與其他轉(zhuǎn)基因生物安全性問(wèn)題相比不是很重要，例如抑制雜草物種、對(duì)非靶標(biāo)生物的影響或者新的病毒的出現(xiàn)?；蛘哒f(shuō)是因?yàn)閷?duì)土壤微生物群的影響難以測(cè)定？轉(zhuǎn)基因植物會(huì)出現(xiàn)什么樣的影響？目前，在大規(guī)模使用轉(zhuǎn)基因植物對(duì)根圍和大部分土壤中微生物群落的影響方面，公認(rèn)的有兩種推測(cè)：</p><p>　　1.由于根分泌物的改變或者釋放抗真菌、抗細(xì)菌活性或其他的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，接近根部的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能組成什么時(shí)候會(huì)發(fā)生

87、變化？</p><p>　　2.根圍細(xì)菌群落什么時(shí)候能捕獲和穩(wěn)定地整合進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物的DNA，尤其是轉(zhuǎn)基因植物中作為標(biāo)記的抗性基因。</p><p>　　第一種推測(cè)可能影響植物健康或者土壤功能，第二種推測(cè)帶來(lái)的影響比較間接——標(biāo)記基因的水平轉(zhuǎn)移，主要是看這種水平轉(zhuǎn)移對(duì)于這些基因擴(kuò)散到其他細(xì)菌群落的影響程度。</p><p>　　傳統(tǒng)的育種技術(shù)和遺傳改造一樣，可能會(huì)影響

88、根圍土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能多樣性，例如根的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)的變化、植物分泌物，這些可能影響植物有益微生物和有害微生物的平衡。值得一提的是，如果遺傳改造是為了提高植物對(duì)細(xì)菌或者真菌病原菌的抵抗力而釋放轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，例如細(xì)胞壁溶解酶或者像T4溶解酵素的化合物、幾丁質(zhì)酶或者抗菌肽等，那么就不能排除土壤微生物群落未知的改變，因此應(yīng)該進(jìn)行評(píng)估。但是，評(píng)估轉(zhuǎn)基因表達(dá)導(dǎo)致的微生物根圍群落潛在的轉(zhuǎn)移十分重要，基礎(chǔ)性的數(shù)據(jù)可以關(guān)聯(lián)自然浮動(dòng)的潛在變化。如前

89、所述，基于核苷酸分析微生物群落可以克服培養(yǎng)方法的缺陷。研究根圍和土壤細(xì)菌群落在時(shí)間上和空間上的變化，必需使用分子生物技術(shù)分析大量的樣本。</p><p>　　最近，人們報(bào)道了很多研究，他們使用了分子指紋圖譜技術(shù)來(lái)分析植物生長(zhǎng)過(guò)程中根圍的動(dòng)力學(xué)和植物物種對(duì)根圍相關(guān)的細(xì)菌群落豐富度的影響，觀察到在植物生長(zhǎng)過(guò)程中根圍微生物群落的相關(guān)豐度發(fā)生巨大的變化。</p><p>　　轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于根圍微生

90、物群落的結(jié)構(gòu)和功能組成的影響在小規(guī)模水平的田間釋放研究比較理想，因?yàn)檠芯匡@示，溫室觀察與田間條件存在很大的不同。為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的影響，田間試驗(yàn)是在隨機(jī)選擇的大田種植轉(zhuǎn)基因植物，并且在不同的點(diǎn)設(shè)置未遺傳改造的父本作為對(duì)照。因?yàn)檫@些田間試驗(yàn)有足夠的重復(fù)可以分析和可以在不同的田間位置不同的植物生長(zhǎng)階段采集樣本，所以這也是研究父本變化和不同的轉(zhuǎn)化之間的有無(wú)潛在不同的理想田間試驗(yàn)。通常人們檢測(cè)不同的轉(zhuǎn)化水平，由于這樣可以看出基因表達(dá)水平和穩(wěn)定性的

91、變化。</p><p>　　至今，只有一少部分研究是關(guān)于分析田間條件下轉(zhuǎn)基因植物對(duì)根圍土壤的細(xì)菌群落組成的潛在影響的。在Dunfield和Germida的研究中，他們?cè)诩幽么笏膫€(gè)不同的地區(qū)分別種植了四種耐除草劑的和四種常規(guī)的油籽，然后用FAME和Biolog CLPP來(lái)分析其兩季的根圍土壤群落特性。轉(zhuǎn)基因耐草甘膦的油籽變種Quest看起來(lái)很獨(dú)特，并且其根圍微生物群落與其他的三種耐草銨磷和四種常規(guī)的油籽的根圍微生物

92、群落不同。其他變種的差異似乎主要是由土壤類型的影響。但是，鑒于轉(zhuǎn)基因變種Quest沒(méi)有與其未轉(zhuǎn)基因的父本作對(duì)照，所以這種差異是否是由遺傳改造引起尚不清楚。Heuer等研究了田間條件下馬鈴薯根圍細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)特性，并且與轉(zhuǎn)基因的表達(dá)T4-熔解酵素的馬鈴薯植株做了比較。與許多其他的轉(zhuǎn)基因植物相比，Düring和Mahn將遺傳改造目標(biāo)改為細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)與植物相關(guān)的細(xì)菌確實(shí)受到了影響，至于易受轉(zhuǎn)基因馬鈴薯影響的胡蘿卜軟腐歐文氏菌明

93、顯的減少了。此外，研究證實(shí)根部檢測(cè)到有釋放的T4熔解酵素，導(dǎo)致根表面有殺菌的能力。產(chǎn)T4熔解酵素兩排，一排是沒(méi)有T4熔解酵素基因的和另一排父本，在兩個(gè)相距很遠(yuǎn)的田間位置和不同的土壤類</p><p>　　在其他的溫室條件下的研究中報(bào)道了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物和過(guò)程的瞬時(shí)的影響。但是，這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)與自然條件變化無(wú)關(guān)。轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于土壤微生物群落的影響比在季節(jié)和田間位置等環(huán)境因素下的影響似乎更相關(guān)。（由于環(huán)境影響已經(jīng)

94、排除，所以結(jié)果更能說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植物對(duì)土壤微生物群落的影響。）</p><p>　　10土壤中DNA的留存和轉(zhuǎn)基因植物DNA與細(xì)菌之間的橫向轉(zhuǎn)移</p><p>　　自然轉(zhuǎn)化是轉(zhuǎn)基因植物基因與細(xì)菌之間發(fā)生橫向轉(zhuǎn)移的最可能機(jī)制。自然轉(zhuǎn)化是指有能力的細(xì)菌可以通過(guò)敏感性的DNA酶來(lái)獲得自由DNA的過(guò)程。細(xì)菌獲得的單鏈DNA或者通過(guò)同源重組被整合進(jìn)細(xì)菌的基因組，或者形成一個(gè)自動(dòng)復(fù)制元件。自然轉(zhuǎn)化提供了

95、一個(gè)有能力的細(xì)菌通過(guò)獲得其周圍的DNA來(lái)產(chǎn)生遺傳多樣性的基因轉(zhuǎn)移機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證明，大于40個(gè)來(lái)自不同環(huán)境的細(xì)菌物種是可以發(fā)生自然轉(zhuǎn)化的。Demaneche等最近發(fā)現(xiàn)可以自然轉(zhuǎn)化的細(xì)菌數(shù)量比估計(jì)的要多。自然轉(zhuǎn)化的前提是，可用的自由DNA；競(jìng)爭(zhēng)性的生長(zhǎng)；獲取并穩(wěn)定的整合捕獲的DNA。但是，關(guān)于像在土壤、堆肥、糞便和污物等不同的環(huán)境條件下，細(xì)菌或植物的DNA的自然轉(zhuǎn)化有多重要，至今仍然不清楚。目前，眾多課題組對(duì)于環(huán)境條件下的自然轉(zhuǎn)化主要有兩方面

96、：</p><p>　　（1）自由DNA可以持續(xù)多長(zhǎng)時(shí)間，例如在土壤中；這些DNA依然可用于自然變換么？</p><p>　　（2）在環(huán)境條件下不同的細(xì)菌物種有多少能達(dá)到可以自然變換的狀態(tài)？</p><p>　　實(shí)驗(yàn)室條件下發(fā)現(xiàn)了基因的瞬間轉(zhuǎn)移，這提供了理解植物DNA轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中的另外一條可能途徑。</p><p>　　不同的課題組研究顯示，

97、盡管DNA酶普遍存在，但是不同條件下都可以檢測(cè)到高分子的自由DNA。有人假設(shè)微生物或者腐敗的植物組織釋放的自由DNA可以作為養(yǎng)料或者自生性細(xì)菌的遺傳信息儲(chǔ)藏庫(kù)。不同的有生命的和無(wú)生命的因素似乎影響土壤中自由DNA的存留時(shí)間，并且關(guān)于最近出版了關(guān)于非無(wú)菌土壤中的DNA存留的一些報(bào)告。微生物活力被認(rèn)為是影響土壤中自由DNA留存的重要生物因素，因?yàn)槲⑸锘盍κ艽碳そ?jīng)常引起DNA酶活力隨著增加。Nielsen等證實(shí)熒光假單胞菌、洋蔥伯克霍德菌和

98、不動(dòng)細(xì)菌屬的細(xì)胞熔解產(chǎn)物是在無(wú)菌的和非無(wú)菌的土壤中轉(zhuǎn)化DNA的可用原材料，并且細(xì)胞殘骸保護(hù)DNA以防止在土壤中失活，在這過(guò)程中細(xì)胞壁或許在細(xì)胞死后起著重要的作用。不同的研究也發(fā)現(xiàn)在微生境和田間條件下轉(zhuǎn)基因植物的DNA有長(zhǎng)時(shí)間的留存。在高溫高濕條件下轉(zhuǎn)基因DNA減少得更快。這兩種因素對(duì)土壤微生物活性都具有重要的影響。Gebhard和Smalla等在田間釋放具有轉(zhuǎn)基因抗叢根病的甜菜然后研究其轉(zhuǎn)基因DNA在土壤中的留存。為檢測(cè)DNA而不依賴于

99、培養(yǎng)方法，他們直接從土壤中提取總?cè)郝銬NA，然后選用三個(gè)針對(duì)轉(zhuǎn)基因DNA的不同的特殊引物來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增</p><p>　　隨著植物的衰老和土壤中微生物對(duì)于植物殘?bào)w的降解，轉(zhuǎn)基因DNA也能隨著被降解。但是，實(shí)測(cè)到轉(zhuǎn)基因植物DNA卻可以躲過(guò)這些降解過(guò)程。長(zhǎng)時(shí)間的留存會(huì)似乎會(huì)加強(qiáng)細(xì)菌轉(zhuǎn)化的可能性，即使是植物釋放的DNA的一小部分。</p><p>　　在田間種植的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的根圍經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)表達(dá)T

100、4熔解酵素的馬鈴薯的重組DNA。作者指出，兩種DNA似乎可以增加轉(zhuǎn)基因植物的擴(kuò)散：成長(zhǎng)的根部系統(tǒng)和花粉。與前面的研究相比，De Vries等運(yùn)用一種新的特殊的生物監(jiān)測(cè)技術(shù)發(fā)現(xiàn)田間土壤中的轉(zhuǎn)基因植物的DNA最長(zhǎng)可以留存達(dá)四年。由于植物DNA可以吸附在土壤顆粒上或者被植物細(xì)胞所保護(hù)，所以這些DNA可以讓植物殘?bào)w附近附著定植的有能力的細(xì)菌所捕獲。直到現(xiàn)在，人們都沒(méi)有弄清楚細(xì)菌是否可以被植物DNA所轉(zhuǎn)化。大量的非細(xì)菌DNA和植物DNA的高甲基化

101、速率被認(rèn)為是阻止抗性基因從轉(zhuǎn)基因植物向細(xì)菌轉(zhuǎn)移的因素。許多人之所以沒(méi)有檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)菌之間的水平基因轉(zhuǎn)移，大概是因?yàn)榧?xì)菌中缺少同源序列或者使用了低轉(zhuǎn)化率的細(xì)菌。但是最近人們證實(shí)，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)室條件下，基于同源重組，Acinetobacter sp. BD413 pFG4ΔnptII可以捕獲和整合轉(zhuǎn)基因植物的DNA。還觀察到，不僅轉(zhuǎn)基因植物的DNA而且轉(zhuǎn)基因植物的勻漿都修復(fù)了317-bp的刪除，這將導(dǎo)致具有抗卡那霉素特性的Acine