小麥篩分子發(fā)育過(guò)程中的編程性細(xì)胞半死亡機(jī)理研究.pdf

1、小麥穎果腹部韌皮部篩分子的主要功能是將光合同化物向穎果胚乳轉(zhuǎn)運(yùn)并貯存在胚乳中。篩分子的發(fā)育經(jīng)歷了細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)（包括核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、部分線粒體和高爾基體和液泡等）的降解（保留了完整的細(xì)胞膜、少量細(xì)胞質(zhì)），最后形成成熟的有活性的篩分子，進(jìn)而履行運(yùn)輸有機(jī)物質(zhì)的功能。已有研究證實(shí)篩分子發(fā)育經(jīng)歷了一個(gè)類似細(xì)胞編程性死亡(PCD)的過(guò)程，但該過(guò)程又有不同的特征，故將其取名為細(xì)胞編程性半死亡。篩分子編程性半死亡機(jī)理目前沒(méi)有明確的結(jié)論，還有許多問(wèn)題亟

2、待解決，如篩分子分化時(shí)細(xì)胞質(zhì)是怎樣被降解的，與液泡是否相關(guān)？篩分子分化時(shí)細(xì)胞內(nèi)pH值如何變化，如何影響酸性蛋白酶活性？細(xì)胞編程性死亡過(guò)程會(huì)停止，是否有植物體自身進(jìn)化的蛋白酶抑制子起作用？為了解決上述問(wèn)題，本研究采用多種技術(shù)手段，如植物顯微技術(shù)、免疫組織和超微細(xì)胞定位技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等開(kāi)展研究。主要得到如下結(jié)論:
　　 1.篩分子發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)上具有以下幾個(gè)特征。
　　 (1)核染色質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)降解，細(xì)胞核沒(méi)有出現(xiàn)分裂

3、。核膜在染色質(zhì)降解完全后仍然保持完整的雙層結(jié)構(gòu)，但是核孔間距增大。細(xì)胞核降解完成后，液泡結(jié)構(gòu)仍然是完整的。
　　 (2)篩分子分化開(kāi)始時(shí)，少量細(xì)胞質(zhì)被降解，花后4.5d時(shí)則有大量細(xì)胞質(zhì)被降解。而細(xì)胞質(zhì)主要是通過(guò)液泡膜內(nèi)陷進(jìn)入液泡中，然后被液泡里的水解酶降解，這種液泡降解細(xì)胞質(zhì)的方式被稱為微自噬。
　　 (3)花后5d和6d，大量細(xì)胞質(zhì)被降解后，部分液泡膜與質(zhì)膜融合，部分液泡膜破裂。液泡膜和質(zhì)膜的融合使得其融合區(qū)間包含了部

4、分細(xì)胞質(zhì)，而液泡膜破裂也使得液泡里的水解酶等物質(zhì)與液泡外其他細(xì)胞質(zhì)互相混合。
　　 (4)花后0d和1d篩分子里內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂成短片段。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段腔不斷擴(kuò)大，并且其始終圍繞小液泡排列，甚至有些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)末端還會(huì)與液泡膜斷裂處相連。
　　 2.利用氫離子熒光探針檢測(cè)不同發(fā)育階段的篩分子內(nèi)酸性環(huán)境變化，結(jié)果顯示篩分子僅在花后5d顯現(xiàn)出極微弱的黃綠色熒光，其他天數(shù)內(nèi)篩分子都顯示藍(lán)色熒光。同時(shí)果皮和花后1d的導(dǎo)管出現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。根

5、據(jù)熒光顏色，以導(dǎo)管和果皮的酸性變化作為參照，發(fā)現(xiàn)篩分子在花后5d細(xì)胞內(nèi)發(fā)生微弱酸性變化。
　　 3.小麥天冬氨酸蛋白酶(WAP1)的免疫組織定位顯示，在篩分子分化過(guò)程中WAP1表達(dá)量先增加后減少至不表達(dá)，花后5d時(shí)達(dá)到最大。WAP1的免疫超微定位顯示，WAP1主要在篩分子液泡里出現(xiàn);液泡膜部分破裂后，均勻地分布在篩分子里。WAP1的mRNA原位雜交結(jié)果顯示，WAP1mRNA在花后2d的維管束里轉(zhuǎn)錄量最大，隨后逐漸減少。mRNA僅

6、在維管束的部分細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄，這部分細(xì)胞體積大，可能是伴胞。
　　 4.CystatinsmRNA的原位雜交結(jié)果顯示，僅少量cystatinsmRNA在花后4d的腹部維管束里轉(zhuǎn)錄，緊臨導(dǎo)管的薄壁細(xì)胞里轉(zhuǎn)錄量較多。其中，cystatinsmRNA還在小麥幼苗種子根篩分子里特異性轉(zhuǎn)錄。
　　 5.組織水平原位檢測(cè)蛋白酶B活性的結(jié)果顯示，花后2d篩分子組織蛋白酶B活性開(kāi)始出現(xiàn)，當(dāng)活性達(dá)到最強(qiáng)后又逐漸減弱。根據(jù)熒光強(qiáng)度判定，花后4d

7、的篩分子里組織蛋白酶B活性最強(qiáng)。另外，組織蛋白酶B活性也出現(xiàn)在發(fā)育的根尖篩分子里。
　　 上述結(jié)果證實(shí)，篩分子編程性半死亡中的細(xì)胞質(zhì)降解主要是由液泡介導(dǎo)的微自噬過(guò)程。待液泡里的細(xì)胞質(zhì)基本降解完全后，液泡膜選擇性的與質(zhì)膜融合（融合的區(qū)間包含少量細(xì)胞質(zhì)，使得部分細(xì)胞質(zhì)得以保留），而且在膜融合的時(shí)候出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)弱酸化。同時(shí)，WAP1和組蛋白酶B活性類似的蛋白酶調(diào)節(jié)篩分子發(fā)育，導(dǎo)致其編程性半死亡發(fā)生。組蛋白酶B活性類似的蛋白酶在篩分子細(xì)胞