Strobilurin類殺菌劑醚菌酯和肟菌酯的作用機(jī)制、檢測(cè)方法研究及其在柑橘中的殘留規(guī)律.pdf

1、柑橘采后經(jīng)常因真菌感染而造成較大的經(jīng)濟(jì)損失,利用殺菌劑控制真菌病害是一種有效的途徑。醚菌酯和肟菌酯屬新型Strobilurin類殺菌劑,具有安全、廣譜、高效的特點(diǎn),可有效防治柑橘采后的真菌病害,但相關(guān)作用機(jī)制及其在柑橘中的殘留檢測(cè)研究報(bào)道較少。本論文針對(duì)醚菌酯和肟菌酯應(yīng)用的生產(chǎn)實(shí)踐需求,開展醚菌酯和肟菌酯的作用機(jī)制、殘留檢測(cè)方法及其在柑橘中降解規(guī)律研究,以促進(jìn)柑橘及其制品的食用安全。主要研究結(jié)果如下:
　　1.醚菌酯和肟菌酯對(duì)三種

2、病原真菌的作用效果及機(jī)制選用柑橘青霉、綠霉、炭疽菌進(jìn)行體外培養(yǎng),當(dāng)培養(yǎng)基中分別含有兩種殺菌劑時(shí),醚菌酯和肟菌酯對(duì)三種病原真菌的半最大效應(yīng)濃度(EC50)分別為13.22,66.92,273.74μg/mL和0.18,0.32,1.37μg/mL。將三種真菌于EC50濃度水平的含醚菌酯和肟菌酯培養(yǎng)基中培養(yǎng),菌絲蛋白含量為檢測(cè)目標(biāo),青霉菌和綠霉菌可溶性蛋白含量分別從3h和1h后降低并持續(xù)至24h,炭疽菌可溶性蛋白含量從開始下降到再次上升只維

3、持了3h,此后則逐漸升高;當(dāng)培養(yǎng)基中同時(shí)含有旁路氧化酶抑制劑SHAM時(shí),醚菌酯和肟菌酯抑制三種病原真菌的EC50濃度水平明顯下降,各菌絲體可溶性蛋白總水平也明顯降低。結(jié)果表明,醚菌酯和肟菌酯能較好地抑制三種病原真菌生長(zhǎng),SHAM與兩種殺菌劑均有協(xié)同作用效果。
　　采用差速離心法獲得真菌線粒體,分別研究0.2-200μg/mL的醚菌酯和肟菌酯對(duì)真菌線粒體內(nèi)膜上四種酶復(fù)合體活性的影響。結(jié)果表明,兩者對(duì)復(fù)合體的活性影響趨同,四種復(fù)合體活

4、性的抑制率與藥劑濃度成正相關(guān),但各處理濃度下的復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ受抑制程度均不如復(fù)合體Ⅲ;相同濃度處理下,醚菌酯和肟菌酯對(duì)青霉菌和綠霉菌中的復(fù)合體Ⅲ抑制程度較炭疽菌的大。醚菌酯和肟菌酯可通過(guò)影響線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性而抑制真菌的生長(zhǎng)。
　　2.醚菌酯和肟菌酯QuEchERS-HPLC同步檢測(cè)方法的建立以AOAC認(rèn)可的QuEchERS法為基礎(chǔ),樣品采用含1％乙酸的乙腈溶液,通過(guò)優(yōu)化吸附劑確定采用PSA:C18(4:1/m:m)作為最

5、佳前處理?xiàng)l件。同步檢測(cè)采用210nm的波長(zhǎng),甲醇:水(80:20)為流動(dòng)相洗脫,醚菌酯和肟菌酯的保留時(shí)間分別為9.3 min和12.3 min。當(dāng)加標(biāo)濃度為1.0,0.5,0.05 mg/kg時(shí),橘肉和橘皮中醚菌酯的平均回收率約為83.93%~95.50%和80.08%~93.77%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD%分別為1.55%~4.50%和1.80%~4.24%;肟菌酯的平均回收率約為80.84%~93.47%和80.00%~91.00%,

6、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%分別為3.00%~4.20%,1.40%~5.20%。醚菌酯和肟菌酯的最低檢出濃度分別為0.005和0.008 mg/kg,符合農(nóng)殘分析的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)要求。
　　3.醚菌酯和肟菌酯ELISA檢測(cè)方法的建立1)將含醚菌酯和肟菌酯共有活性基團(tuán)的(E)-2(2-溴甲基苯基)-2-甲氧亞氨基乙酸甲酯(OEBr)與巰基丙酸反應(yīng)獲得羧基,以其為連接臂,采用活化酯法、混合酸酐法分別制備免疫原和包被原,反應(yīng)產(chǎn)物分別利用紫外吸收掃描

7、與結(jié)合比的測(cè)定、紅外、質(zhì)譜、核磁、SDS-PAGE方法進(jìn)行鑒定表明,免疫原和包被原合成成功,其中免疫原的結(jié)合比為12.8:1,達(dá)到動(dòng)物免疫的要求。
　　2)免疫原與弗氏佐劑充分乳化制備疫苗,采用多點(diǎn)皮下、腿部肌肉免疫3只新西蘭大白兔,為期3個(gè)月。當(dāng)3只兔子的抗血清效價(jià)分別為64000,32000,32000且不再上升時(shí),采用效價(jià)最高的抗血清進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
　　3)以包被原Hapten-OVA和獲得的最高效價(jià)抗體(Ab)建立

8、 IC-ELISA法。該方法對(duì)通用半抗原的IC50為9.5μg/mL,IC10為0.005μg/mL;抗體對(duì)醚菌酯和肟菌酯有較好的特異性和靈敏性,IC50分別為15.3,19.6μg/mL,IC10分別為0.0074,0.011μg/mL;但對(duì)唑菌銨酯的交叉反應(yīng)率小于0.1%。結(jié)果表明該方法可作為醚菌酯和肟菌酯的酶聯(lián)免疫分析使用。
　　4)采用建立的IC-ELISA檢測(cè)柑橘樣品中醚菌酯和肟菌酯,檢測(cè)結(jié)果表明當(dāng)加標(biāo)濃度為100,10

9、,1μg/mL時(shí),醚菌酯回收率分別為104.35%,95.57%,82.73%,RSD%分別為11.1%,10.8%,8.8%;肟菌酯回收率分別為92.43%,91.75%,91.10%,RSD%分別為7.4%,10.2%,10.9%,此方法符合殺菌劑痕量分析的要求。
　　4.柑橘中醚菌酯和肟菌酯的殘留規(guī)律研究用建立的QuEchERS-HPLC同步檢測(cè)方法,探討橘皮和橘肉中的醚菌酯和肟菌酯的降解規(guī)律。結(jié)果表明,儲(chǔ)藏12天后97%的