FTO、METTL3基因表達(dá)對(duì)豬脂肪細(xì)胞mRNAN6-甲基腺苷水平及脂肪沉積的影響研究.pdf

1、動(dòng)物體脂過度沉積不僅降低了畜產(chǎn)品的質(zhì)量而且威脅人類健康，因此深入了解體脂沉積的調(diào)節(jié)機(jī)制并通過營(yíng)養(yǎng)手段合理調(diào)控豬體脂分配已成為畜牧業(yè)亟待解決的問題之一。肥胖基因(FTO)是通過GWAS技術(shù)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)與肥胖相關(guān)的候選基因。研究表明FTO-/-小鼠體脂含量下降，而增加FTO拷貝數(shù)能促進(jìn)小鼠體脂沉積，但FTO基因表達(dá)與豬脂肪沉積的研究較少。同時(shí)，F(xiàn)TO是一種mRNAN6-甲基腺苷(m6A)去甲基化酶，與m6A甲基轉(zhuǎn)移酶(METTL3)共同調(diào)控m

2、RNA中m6A甲基化水平。FTO基因表達(dá)對(duì)豬脂肪代謝是否具有調(diào)控作用，并且是否與催化m6A去甲基化相關(guān)，目前尚未見報(bào)道。豬與人類具有相似的代謝功能、心血管系統(tǒng)及成比例器官大小，以豬為動(dòng)物模型開展脂肪代謝機(jī)制研究，對(duì)人類健康也具有重要意義。因此，本研究以瘦肉型長(zhǎng)白豬、肉脂型金華豬及雜交品種長(zhǎng)金豬為動(dòng)物模型，在比較不同豬種胴體肥胖表型差異的基礎(chǔ)上，首先利用熒光定量PCR、免疫印跡等技術(shù)研究了豬FTO和METTL3基因表達(dá)的組織特異性、品種差

3、異及脂肪組織mRNA m6A水平的品種差異，其次利用基因超表達(dá)及沉默技術(shù)研究了FTO和METTL3基因表達(dá)對(duì)豬脂肪細(xì)胞mRNA m6A水平、脂肪沉積的影響，并進(jìn)一步利用甲基化抑制劑環(huán)亮氨酸和甲基供體三甲基甘氨酸研究了m6A水平變化對(duì)豬脂肪細(xì)胞脂肪沉積的影響，旨在探討FTO、METTL3基因表達(dá)以及甲基供體和甲基化抑制劑是否能夠調(diào)控mRNA m6A甲基化進(jìn)而影響豬體脂沉積，為從mRNA表觀遺傳學(xué)角度深入研究豬脂肪沉積的分子機(jī)制和優(yōu)質(zhì)、高效

4、的豬肉生產(chǎn)提供理論依據(jù)，同時(shí)為人類肥胖相關(guān)疾病研究提供借鑒。主要研究結(jié)果如下:
　　試驗(yàn)一:長(zhǎng)白豬、金華豬及雜交品種長(zhǎng)金豬胴體肥胖表型差異的比較研究
　　以180日齡瘦肉型長(zhǎng)白豬、肉脂型金華豬及雜交品種長(zhǎng)金豬為動(dòng)物模型，比較研究了三個(gè)豬種在肥胖相關(guān)表型方面的差異。180日齡金華豬皮脂率和內(nèi)臟脂肪率顯著高于長(zhǎng)白豬和長(zhǎng)金豬(p＜0.05)，其中皮脂率分別是長(zhǎng)白豬和長(zhǎng)金豬的2.2倍和1.75倍，而內(nèi)臟脂肪率則分別為4.35倍和1.

5、57倍;長(zhǎng)金豬與長(zhǎng)白豬相比皮脂率差異不顯著，但內(nèi)臟脂肪率顯著高于長(zhǎng)白豬(p＜0.05)。金華豬、長(zhǎng)金豬、長(zhǎng)白豬肌內(nèi)脂肪含量分別為3.49％、2.98％和1.22％，品種之間差異顯著(p＜0.05)。脂肪組織切片染色結(jié)果表明，無(wú)論是皮下脂肪細(xì)胞還是內(nèi)臟脂肪細(xì)胞面積比較均呈現(xiàn)金華豬大于長(zhǎng)金豬大于長(zhǎng)白豬的趨勢(shì)。提示，瘦肉型長(zhǎng)白豬、雜交品種長(zhǎng)金豬及肉脂型金華豬體脂（皮下脂肪、內(nèi)臟脂肪、肌內(nèi)脂肪）沉積存在顯著差異，可作為進(jìn)一步開展脂肪沉積機(jī)制研究

6、的動(dòng)物模型。
　　試驗(yàn)二:豬體內(nèi)FTO基因表達(dá)的組織特異性、品種差異及脂肪組織mRNA m6A甲基化水平研究
　　下丘腦是動(dòng)物的攝食中樞，而脂肪和肝臟組織是脂肪合成的主要場(chǎng)所，去甲基化酶FTO基因表達(dá)的組織特異性結(jié)果表明，三個(gè)品種豬中FTO mRNA均在下丘腦中表達(dá)最高，脂肪以及肝臟組織中表達(dá)低于下丘腦，但顯著高于各肌肉組織（P＜0.05）。甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3表達(dá)的組織特異性結(jié)果表明，三個(gè)品種豬中METTL3 mRNA均

7、在脂肪、肝臟和下丘腦組織中表達(dá)較高，在肌肉組織中表達(dá)較低，提示FTO、METTL3基因表達(dá)可能與豬能量代謝和脂肪沉積相關(guān)。
　　進(jìn)一步對(duì)FTO、METTL3基因高表達(dá)的脂肪、肝臟和下丘腦組織進(jìn)行品種差異比較。FTO基因的品種差異結(jié)果表明，脂肪組織中FTO mRNA水平金華豬均高于長(zhǎng)金豬和長(zhǎng)白豬，其中在腹脂、腹膜后脂肪、腸系膜脂肪及心包脂肪中顯著高于長(zhǎng)金豬和長(zhǎng)白豬(p＜0.05)。在肝臟和下丘腦組織中，金華豬FTO mRNA水平也顯

8、著高于長(zhǎng)金豬和長(zhǎng)白豬(p＜0.05)。FTO蛋白水平與mRNA水平的品種差異結(jié)果一致。METTL3基因的品種差異結(jié)果表明，脂肪組織中長(zhǎng)白豬METTL3 mRNA水平均高于長(zhǎng)金豬和金華豬，其中在背脂、腹膜后脂肪及大網(wǎng)膜脂肪中顯著高于長(zhǎng)金豬和金華豬(P＜0.05)。在肝臟與下丘腦組織中，METTL3基因表達(dá)品種間無(wú)顯著差異。METTL3蛋白水平與mRNA水平的品種差異結(jié)果一致。與瘦肉型長(zhǎng)白豬相比，肥胖型金華豬FTO表達(dá)水平較高而METTL3

9、表達(dá)水平較低，進(jìn)一步說明豬體內(nèi)去甲基化酶FTO及甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的表達(dá)與脂肪沉積密切相關(guān)。
　　在檢測(cè)了脂肪組織去甲基酶FTO和甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3基因表達(dá)品種差異的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較了不同品種豬脂肪組織mRNA m6A甲基化水平的差異。結(jié)果表明，背脂、腹脂、腹膜后脂肪、腸系膜脂肪及心包脂肪組織中，長(zhǎng)白豬mRNA m6A甲基化水平高于長(zhǎng)金豬和金華豬，金華豬水平最低，提示mRNA m6A甲基化水平與豬肥胖表型呈負(fù)相關(guān)，m6A

10、甲基化水平可能在豬體脂沉積中發(fā)揮重要作用。
　　試驗(yàn)三:FTO、METTL3基因表達(dá)對(duì)豬脂肪細(xì)胞mRNA m6A水平及脂肪沉積的影響
　　通過構(gòu)建FTO、METTL3基因的超表達(dá)質(zhì)粒和sh RNA慢病毒干擾載體，建立豬前體脂肪細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，研究了FTO、METTL3基因超表達(dá)或干擾對(duì)豬脂肪細(xì)胞mRNAm6A甲基化水平、脂肪沉積及對(duì)脂肪代謝相關(guān)功能基因表達(dá)的影響。超表達(dá)去甲基酶FTO基因顯著降低了豬脂肪細(xì)胞mRNA m6A

11、水平(p＜0.05)，提高了細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量(p＜0.05)，并降低了培養(yǎng)基中的甘油含量，提高了成脂分化相關(guān)基因c/EBPβ(p＜0.05)和PPARγ、脂肪酸從頭合成相關(guān)基因FAS(p＜0.05)和ACC的表達(dá)，同時(shí)降低了脂肪分解相關(guān)基因ATGL(p＜0.05)、HSL(p＜0.05)的表達(dá)。FTO shRNA慢病毒侵染豬脂肪細(xì)胞顯著提高了細(xì)胞mRNA m6A甲基化水平(p＜0.05)，顯著降低了細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯含量(p＜0.05)

12、，極顯著地提高了培養(yǎng)基中甘油含量(p＜0.01)，同時(shí)，F(xiàn)TO shRNA慢病毒侵染極顯著降低了豬脂肪細(xì)胞中成脂分化相關(guān)成脂分化相關(guān)基因c/EBPβ(p＜0.05)、PPARγ的表達(dá)(p＜0.01)，降低了脂肪酸從頭合成相關(guān)基因FAS(p＜0.05)、ACC(p＜0.01)的表達(dá)，同時(shí)提高了脂肪分解相關(guān)基因ATGL(p＜0.05)、HSL的表達(dá)。上述結(jié)果提示，作為一種RNA去甲基酶，F(xiàn)TO基因表達(dá)能夠負(fù)調(diào)控豬脂肪細(xì)胞mRNA m6A甲基

13、化水平，同時(shí)正調(diào)控脂肪沉積。
　　超表達(dá)甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3基因極顯著提高了豬脂肪細(xì)胞mRNA m6A甲基化水平(p＜0.05)，顯著降低細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量(p＜0.05)，并提高了培養(yǎng)基中的甘油含量(p＜0.05)，降低了成脂分化相關(guān)基因PPARγ(p＜0.01)、脂肪合成相關(guān)基因FAS(p＜0.05)和ACC的表達(dá)，同時(shí)脂肪分解相關(guān)基因ATGL、HSL的表達(dá)有升高的趨勢(shì)。METTL3shRNA慢病毒侵染豬脂肪細(xì)胞對(duì)細(xì)胞mRN

14、A m6A甲基化水平、細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量及培養(yǎng)基中甘油含量均無(wú)顯著影響。上述結(jié)果提示，甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3能夠正調(diào)控豬脂肪細(xì)胞mRNA m6A甲基化水平，同時(shí)負(fù)調(diào)控脂肪沉積。
　　試驗(yàn)四:豬脂肪細(xì)胞mRNA m6A水平的調(diào)控及其對(duì)脂肪沉積的影響
　　脂肪細(xì)胞mRNA m6A甲基化水平除了受到去甲基酶FTO和甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3的催化調(diào)控，還與活性甲基底物（S-腺苷甲硫氨酸）濃度有關(guān)。因此，本試驗(yàn)通過外源添加甲基化抑制劑環(huán)

15、亮氨酸及甲基化供體三甲基甘氨酸，研究脂肪細(xì)胞mRNA m6A甲基化水平對(duì)脂肪沉積的影響。在調(diào)控mRNA m6A甲基化水平方面:環(huán)亮氨酸處理顯著抑制豬脂肪細(xì)胞mRNA m6A的甲基化，三甲基甘氨酸能顯著提高豬脂肪細(xì)胞mRNA m6A甲基化水平，且均呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。在對(duì)細(xì)胞脂肪沉積的影響方面:環(huán)亮氨酸極顯著提高了豬脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量(p＜0.01)，并顯著降低了培養(yǎng)基中的甘油含量(p＜0.05)，促進(jìn)了脂肪沉積;相反，三甲基甘氨酸顯著

16、降低豬脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量(p＜0.05)，同時(shí)提高了培養(yǎng)基中的甘油含量，抑制脂肪沉積。在成脂代謝相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)方面:環(huán)亮氨酸處理顯著提高了成脂分化相關(guān)基因c/EBPβ、 PPARγ的基因表達(dá)(p＜0.05)，提高了脂肪酸從頭合成相關(guān)基因FAS、ACC(p＜0.05)的表達(dá)，顯著降低了脂肪分解相關(guān)基因ATGL(p＜0.05)、HSL(p＜0.01)的表達(dá);與環(huán)亮氨酸相反，三甲基甘氨酸處理顯著降低了成脂分化相關(guān)基因c/EBPβ(p＜0

17、.01)、PPARγ(p＜0.05)的基因表達(dá)，有降低脂肪酸從頭合成相關(guān)基因FAS、ACC基因表達(dá)的趨勢(shì)，同時(shí)提高了脂肪分解相關(guān)基因ATGL、HSL(p＜0.01)的基因表達(dá)。脂肪代謝相關(guān)基因表達(dá)結(jié)果與細(xì)胞內(nèi)的脂肪沉積變化一致。上述結(jié)果提示，甲基化抑制劑和甲基供體能夠通過改變活性甲基底物（S-腺苷甲硫氨酸）的濃度，調(diào)控mRNA m6A甲基化水平，進(jìn)而影響脂肪沉積。
　　綜上所述，去甲基酶FTO及甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3共同調(diào)控了豬脂