綠僵菌核內(nèi)鋅指轉(zhuǎn)錄因子MaCrz1基因功能研究.pdf

1、綠僵菌是一種重要的昆蟲致病真菌,作為生物殺蟲劑在防治農(nóng)業(yè)害蟲方面具有巨大潛力。其作為生物農(nóng)藥優(yōu)勢明顯,如對生態(tài)環(huán)境安全無污染,無農(nóng)藥殘留,寄主不易產(chǎn)生耐藥性,能夠有效的防治農(nóng)業(yè)害蟲的再次猖獗,對于刺吸式害蟲等害蟲的生物防治中尤其占據(jù)優(yōu)勢;但作為新型的農(nóng)藥,生物農(nóng)藥的缺陷也極為明顯,如侵染宿主時(shí)的效果慢周期長、防治效果不穩(wěn)定,這些缺陷,嚴(yán)重阻礙了綠僵菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的大規(guī)模應(yīng)用,而本研究旨在通過基因工程技術(shù),闡明鈣調(diào)磷酸酶應(yīng)答鋅指轉(zhuǎn)錄因子C

2、rz1基因?qū)τ诶ハx致病真菌綠僵菌抗逆性和毒力的影響,提高對生物殺蟲劑的認(rèn)識,對于提高綠僵菌毒力及環(huán)境適應(yīng)性奠定一定的理論基礎(chǔ),以改善生物殺蟲劑的局限性。
　　本研究以昆蟲病原真菌綠僵菌為材料,利用基因敲除及回復(fù)技術(shù)方法研究MaCrz1基因的功能,主要的研究結(jié)果如下:
　　1)MaCrz1生物信息學(xué)分析根據(jù)蝗綠僵菌基因組序列設(shè)計(jì)引物,測序獲得了轉(zhuǎn)錄因子全長序列,命名為MaCrz1,預(yù)測其編碼729個(gè)氨基酸,具有2個(gè)相似的C2H

3、2鋅指結(jié)構(gòu)域。
　　2)獲得MaCrz1敲除及回復(fù)突變菌株構(gòu)建了MaCrz1的敲除及回復(fù)載體,經(jīng)PCR及Southern雜交驗(yàn)證獲得正確的敲除及回復(fù)突變菌株。
　　3)MaCrz1影響綠僵菌對于鈣離子的敏感性觀察敲除MaCrz1菌株在加入鈣離子培養(yǎng)基中的生長情況,結(jié)果表明其生長較野生型和回復(fù)菌株明顯受到抑制,暗示MaCrz1在調(diào)控胞內(nèi)鈣離子平衡中起重要作用。
　　4)MaCrz1影響綠僵菌的抗逆性以及抗氧化性測試MaC

4、rz1敲除菌株在加入細(xì)胞壁破壞劑及氧化劑等培養(yǎng)基中的生長情況,發(fā)現(xiàn)敲除菌株的生長受到明顯抑制,說明MaCrz1在綠僵菌的抗逆及抗氧化方面具有重要功能。
　　5)MaCrz1影響綠僵菌抗紫外能力經(jīng)過紫外處理后,ΔMaCrz1萌發(fā)率下降50％所需照射時(shí)間(GT50)僅需2.9h,而野生型和回復(fù)菌株的GT50分別為6.5h和5.9h,說明ΔMaCrz1敲除菌株的抗紫外能力明顯下降。
　　6)MaCrz1影響綠僵菌的致病性敲除MaC

5、rz1顯著減弱了突變菌株的毒力,在體外點(diǎn)滴實(shí)驗(yàn)中,敲除菌株對東亞飛蝗的半致死時(shí)間顯著高于野生型,而在體內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)中,野生型菌株,敲除菌株和回復(fù)菌株三者的半致死時(shí)間無明顯差異。
　　7)MaCrz1影響綠僵菌附著胞的形成利用蝗蟲后翅誘導(dǎo)蝗綠僵菌形成附著胞,MaCrz1敲除后,綠僵菌形成附著胞的能力受到抑制。
　　8)MaCrz1影響綠僵菌細(xì)胞壁的完整性對綠僵菌細(xì)胞壁多糖幾丁質(zhì)及β-1-3葡聚糖的染色分析,發(fā)現(xiàn)敲除菌株的兩種多糖