蝦虎魚(yú)和黃顙魚(yú)CPT I的克隆、表達(dá)、動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及對(duì)鋅的影響研究.pdf

1、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(CPTⅠ)是線粒體脂肪酸β-氧化的一種“限速酶”，它在脊椎動(dòng)物中控制長(zhǎng)鏈脂肪酸的β氧化，在降解脂肪過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。近年來(lái)，哺乳動(dòng)物中對(duì)于CPTⅠ基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究取得了一定程度的進(jìn)展。但是卻很少有對(duì)魚(yú)類(lèi)CPTⅠ基因研究和酶學(xué)性質(zhì)的相關(guān)報(bào)道，也沒(méi)有任何研究涉及外源營(yíng)養(yǎng)素對(duì)魚(yú)類(lèi)CPTⅠ基因表達(dá)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響。鋅是魚(yú)類(lèi)一種必需的微量元素，它的存在維系著魚(yú)類(lèi)生理發(fā)育的不同功能。迄今大量的學(xué)者研究了鋅對(duì)魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)、

2、金屬富集、氧化應(yīng)激和組織病變等方面的影響，但是很少有學(xué)者關(guān)注鋅對(duì)魚(yú)類(lèi)脂代謝的影響。本論文克隆了矛尾復(fù)蝦虎魚(yú)（Javelingoby,Synechogobiushasta）和黃顙魚(yú)（yellowcatfish，Pelteobagrusfulvidraco）CPTⅠ的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其結(jié)構(gòu)、進(jìn)化、表達(dá)和動(dòng)力學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。同時(shí)從CPTⅠ的基因表達(dá)和動(dòng)力學(xué)的角度探討了水體和飼料鋅水平對(duì)CPTⅠ的影響機(jī)制。
　　論文的主要研究結(jié)果

3、和結(jié)論如下:
　　1矛尾復(fù)蝦虎魚(yú)CPTⅠ的克隆與動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的研究
　　在脊椎動(dòng)物中，CPTⅠ的調(diào)節(jié)在控制脂肪酸代謝方面起著重要的作用。在當(dāng)前的研究中，我們克隆了蝦虎魚(yú)CPTⅠ的cDNA全序列，分別為CPTⅠα1a-1a、CPTⅠα1a-1b、CPTⅠα1a-1c、CPTⅠα1a-2、CPTⅠα2a、CPTⅠα2b1a、CPTⅠα2b1b和CPTⅠβ。進(jìn)化分析顯示:CPTⅠ基因的重復(fù)形成CPTⅠα和CPTⅠβ，CPTⅠα基因的

4、重復(fù)形成CPTⅠα1和CPTⅠα2，CPTⅠα2基因進(jìn)一步重復(fù)形成CPTⅠα2a和CPTⅠα2b，CPTⅠα2b基因重復(fù)導(dǎo)致CPTⅠα2b1a和CPTⅠα2b1b的產(chǎn)生。CPTⅠα1a基因的選擇性剪切形成4種CPTⅠ剪切突變體，分別為CPTⅠα1a-1a、CPTⅠα1a-1b、CPTⅠα1a-1c和CPTⅠα1a-2。CPTⅠ氨基酸序列比對(duì)和跨膜域分析表明蝦虎魚(yú)出現(xiàn)了關(guān)鍵氨基酸的替換和跨膜域的變化。關(guān)鍵氨基酸的替換和跨膜域的改變可能影響

5、CPTⅠ對(duì)丙二酸單酰輔酶A(M-CoA)的敏感性或者CPTⅠ的催化活性，賦予魚(yú)類(lèi)CPTⅠ新的酶學(xué)性質(zhì)。
　　為了深入了解蝦虎魚(yú)CPTⅠ酶學(xué)性質(zhì)，我們分離了肝臟、心臟、肌肉、腸道和脾臟的線粒體，然后采用酶動(dòng)力學(xué)的方法測(cè)定了Michaelis-Menten常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。結(jié)果顯示:CPTⅠ適宜的反應(yīng)溫度是34-40℃，最佳pH是7.4，適宜的孵育時(shí)間是5-25min，適宜的線粒體蛋白濃度為120μg/ml。蝦虎魚(yú)CPT

6、Ⅰ的動(dòng)力學(xué)分析符合Michaelis-Menten規(guī)律。肉堿Km值在肌肉中最高，在其它組織中沒(méi)有顯著差異。棕櫚酰輔酶A(P-CoA)的Km值在肝臟中最高，在肌肉中最低，在其它組織中沒(méi)有顯著差異。催化效率(Vmax/Km)在心臟中最高，在肝臟中最低。綜上所述，我們的結(jié)果表明了不同組織中的CPTⅠ動(dòng)力學(xué)的差異可能反映了脂肪酸氧化的能力。蝦虎魚(yú)肝臟最低的CPTⅠ催化效率可能是蝦虎魚(yú)易形成“脂肪肝“的一種重要原因。
　　2黃顙魚(yú)CPTⅠ的

7、克隆與表達(dá)的研究
　　在當(dāng)前的研究中，采用逆轉(zhuǎn)錄PCR和快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法，我們成功克隆得到了黃顙魚(yú)CPTⅠ4種構(gòu)型的cDNA全序列。根據(jù)進(jìn)化關(guān)系，我們命名為CPTⅠα1b、CPTⅠα1a、CPTⅠα2a和CPTⅠβ。CPTⅠ的進(jìn)化分析暗示黃顙魚(yú)CPTⅠα1a和CPTⅠα1b的產(chǎn)生可能是由于CPTⅠα1基因的倍增。CPTⅠα2僅存在魚(yú)類(lèi)中，可能是CPTⅠα的一種亞家族。由于哺乳動(dòng)物僅有一個(gè)單拷貝的CPTⅠα基因

8、，因此我們的結(jié)果暗示黃顙魚(yú)多重的CPTⅠ基因拷貝可能源于魚(yú)類(lèi)特異性的基因組倍增事件。另外，我們將黃顙魚(yú)CPTⅠ的氨基酸序列和其它物種進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明黃顙魚(yú)出現(xiàn)了關(guān)鍵氨基酸的替換，例如Asp17，Val19，Ser24和Ala275。這些氨基酸同樣出現(xiàn)在其它魚(yú)類(lèi)中，顯示了和哺乳動(dòng)物巨大差異。我們進(jìn)一步采用Tmpred軟件分析了黃顙魚(yú)CPTⅠ的跨膜域，結(jié)果顯示CPTⅠα1a和CPTⅠα1b的氮端比哺乳動(dòng)物CPTⅠα的更短，但是兩個(gè)跨膜域之

9、間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)比哺乳動(dòng)物CPTⅠα的更長(zhǎng)。關(guān)鍵氨基酸的替換和跨膜域的改變可能影響CPTⅠ對(duì)M-CoA的敏感性或者CPTⅠ的催化活性，賦予魚(yú)類(lèi)CPTⅠ新的酶學(xué)性質(zhì)。
　　同時(shí)，我們通過(guò)熒光定量的方法分析了黃顙魚(yú)4種CPTⅠ構(gòu)型在肝臟、肌肉、心臟、腸道、鰓、腦、脾臟和腎臟中的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，4種構(gòu)型均在上述組織中表達(dá)，但是有量的差異。CPTⅠα1a和CPTⅠβ傾向于在心臟和肌肉中表達(dá)，CPTⅠα1b和CPTⅠα2a的mRNA

10、水平分別在肝臟和鰓中表達(dá)最高。我們進(jìn)一步通過(guò)相同的方法檢測(cè)了4種CPTⅠ構(gòu)型在黃顙魚(yú)仔魚(yú)，幼魚(yú)和成魚(yú)肝臟、心臟和肌肉中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示構(gòu)型的轉(zhuǎn)變貫穿于黃顙魚(yú)的整個(gè)發(fā)育階段。4種構(gòu)型的共表達(dá)和發(fā)育的構(gòu)型轉(zhuǎn)換暗示了魚(yú)類(lèi)更加復(fù)雜的脂肪的利用，可能有助于不同組織中脂肪酸氧化的精準(zhǔn)控制。
　　3黃顙魚(yú)CPTⅠ動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的研究
　　為了深入了解黃顙魚(yú)CPTⅠ動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，我們分離了肝臟、心臟、肌肉、腸道和脾臟的線粒體，然后采用酶動(dòng)力學(xué)

11、的方法測(cè)定了Michaelis-Menten常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax。結(jié)果顯示:CPTⅠ的最適的反應(yīng)溫度是36℃，最佳pH是8，適宜的孵育時(shí)間是3-20min，適宜的線粒體蛋白濃度為25-200μg/ml。黃顙魚(yú)CPTⅠ的動(dòng)力學(xué)分析符合Michaelis-Menten規(guī)律。肉堿Km值在腸道中最高，在脾臟中最低。反之，P-CoA的Km值在脾臟中最高，在腸道中最低。肝臟和心臟具有最大的Vmax值，肌肉和脾臟具有最低的Vmax值。相似地

12、，催化效率(Vmax/Km)在肝臟和心臟中最高，在肌肉中最低。另外，不同組織中的CPTⅠ酶活顯示了和Vmax相似的趨勢(shì)。綜上所述，我們的結(jié)果表明不同組織中的CPTⅠ動(dòng)力學(xué)的差異可能反映了脂肪酸氧化的能力。在另一方面，與哺乳動(dòng)物相比，黃顙魚(yú)不同組織中Km差異顯得很微弱，可能暗示物種的特異性。
　　4水體慢性和急性鋅暴露對(duì)黃顙魚(yú)脂肪沉積、肉堿組成、CPTⅠ的表達(dá)及其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響
　　本實(shí)驗(yàn)是在Zn2+濃度分別為0.05mgl

13、-1（對(duì)照）、0.35mgl-1和0.86mgl-1的水體中對(duì)黃顙魚(yú)進(jìn)行為期64d的慢性暴露實(shí)驗(yàn)，和在Zn2+濃度分別為0.05mgl-1（對(duì)照）和4.71mgl-1的水體中對(duì)黃顙魚(yú)進(jìn)行為期96h的急性暴露實(shí)驗(yàn)，然后研究了水體慢性和急性鋅暴露對(duì)黃顙魚(yú)生長(zhǎng)、脂肪沉積、肉堿組成、CPTⅠ的表達(dá)及其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響。慢性和急性鋅暴露對(duì)黃顙魚(yú)生長(zhǎng)有抑制作用。慢性鋅暴露顯著增加了肝臟脂肪的含量(P＜0.05)，相反，急性鋅暴露顯著減少了肝臟脂肪的

14、含量(P＜0.05)，無(wú)論是慢性還是急性鋅暴露都顯著減少了肌肉脂肪的含量(P＜0.05)。慢性鋅暴露減少了肝臟Michaelis-Menten常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax(P＜0.05)，但是在肌肉中兩參數(shù)呈現(xiàn)相反趨勢(shì)（Km減少，Vmax增加）。慢性鋅暴露也顯著影響了肝臟游離肉堿(FC)，總?cè)鈮A(TC)和?；鈮A的含量(AC)，但并不影響肌肉各種肉堿組成的含量。慢性和急性鋅暴露也影響了黃顙魚(yú)肝臟和肌肉4種CPTⅠ構(gòu)型的表達(dá)，即CPTⅠ

15、a1b、CPTⅠb、CPTⅠa2a和CPTⅠa。進(jìn)一步分析，我們發(fā)現(xiàn)了構(gòu)型的表達(dá)和Km，以及和Vmax呈現(xiàn)了很好的相關(guān)性。總之，慢性和急性鋅暴露差異地影響了組織脂肪的沉積，CPTⅠ的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)及其表達(dá)水平。該研究提供了鋅暴露影響脂代謝的一種新機(jī)制，也加深了我們對(duì)魚(yú)類(lèi)鋅毒理的認(rèn)識(shí)。
　　5飼料鋅缺乏和過(guò)量對(duì)黃顙魚(yú)脂肪沉積、肉堿組成、CPTⅠ的表達(dá)及其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響
　　黃顙魚(yú)分別投喂三種不同鋅水平的飼料20mgkg-1（對(duì)照

16、），11.45mgkg-1（缺乏）和155mgkg-1（過(guò)量），實(shí)驗(yàn)周期為8周，然后研究了飼料鋅缺乏和過(guò)量對(duì)黃顙魚(yú)生長(zhǎng)、脂肪沉積、肉堿組成、CPTⅠ的表達(dá)及其動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的影響。結(jié)果顯示:鋅水平不能顯著影響黃顙魚(yú)生長(zhǎng)(P＞0.05)，鋅缺乏傾向增加肝臟和肌肉脂肪的含量(P＞0.05)，但是過(guò)量鋅顯著減少了肝臟和肌肉的脂肪含量(P＜0.05)。在肝臟中，鋅缺乏顯著增加了FC，AC和TC的含量(P＜0.05)，但是并不能顯著影響FC/TC和A

17、C/FC的比率(P＞0.05)。鋅過(guò)量也顯著增加了TC和AC的含量，但是AC/FC值增加，F(xiàn)C的含量和FC/TC值減少。在肌肉中，鋅缺乏增加了FC的含量，但是鋅過(guò)量減少了FC的含量。相似地，鋅缺乏和過(guò)量差異地影響了AC/FC和FC/TC的值。鋅缺乏減少了肝臟和肌肉Km和Vmax值，但是鋅過(guò)量增加Km和Vmax值。鋅缺乏和過(guò)量也影響了黃顙魚(yú)肝臟和肌肉4種CPTⅠ構(gòu)型的表達(dá)，即CPTⅠa1b，CPTⅠb，CPTⅠa2a和CPTⅠa。進(jìn)一步分