三種品系雞對(duì)馬立克氏病病毒易感性差異的比較研究.pdf

1、馬立克氏病(Marek’ s Disease，MD)是由馬立克氏病病毒(Marek’ s Disease Virus,MDV)引起的雞群常見的具有高度傳染性的淋巴細(xì)胞增生性疾病。該病以胸腺法氏囊萎縮，外周神經(jīng)、各個(gè)臟器、肌肉、皮膚中單核細(xì)胞浸潤以及由于外周神經(jīng)腫瘤細(xì)胞的集聚而導(dǎo)致的半癱瘓或完全癱瘓為典型特征。MDV在淋巴細(xì)胞中復(fù)制，并潛伏感染CD4+T淋巴細(xì)胞。潛伏性感染的CD4+T淋巴細(xì)胞將病毒粒子攜帶到內(nèi)臟器官、外周神經(jīng)及羽毛囊上皮

2、中。感染MDV的雞羽毛囊上皮中有囊膜的病毒粒子可脫離細(xì)胞而存在，帶病毒的皮屑的脫落可對(duì)雞群和環(huán)境造成污染。根據(jù)雞群對(duì)MD致瘤的遺傳抗性，美國農(nóng)業(yè)部禽病與腫瘤學(xué)研究所已將白來航雞分為抗MD品系雞（63）和易感MD品系雞（72和15I5×71）。免疫同一MD疫苗后,MD遺傳抗性品系雞對(duì)MD超強(qiáng)毒力株有更強(qiáng)的抗性,表現(xiàn)為低死亡率。本研究成功建立了63和72品系雞動(dòng)物模型，用于比較兩種品系雞對(duì)MDV感染產(chǎn)生的不同免疫反應(yīng)。并進(jìn)一步建立了15I5

3、×71品系雞動(dòng)物模型，探究皮膚對(duì)MDV感染產(chǎn)生的免疫反應(yīng)及其機(jī)理。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：63和72品系雞對(duì)MDV免疫反應(yīng)的比較。1日齡63和72品系雞，分別隨機(jī)分為兩組（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組），每組25只。12日齡時(shí)，腹腔注射rMd5-BAC（vvMDV），劑量為2000PFU/只，對(duì)照組不攻毒。攻毒后第21天，雞群出現(xiàn)明顯的免疫抑制癥狀，采集雞冠和脾臟組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析、組織病理學(xué)分析、革蘭氏染色、反轉(zhuǎn)錄PCR以

4、及熒光定量PCR方法，來探究63和72品系雞對(duì)MDV感染產(chǎn)生的不同免疫反應(yīng)。63和72品系雞有相同的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）單倍型（B2/B2），其中，63品系雞為MD抗性品系雞，在感染MDV后，除表現(xiàn)典型的MD相關(guān)癥狀外，還出現(xiàn)了嚴(yán)重的雞冠和雞爪的壞疽現(xiàn)象。72品系雞為MD易感品系雞，雖未出現(xiàn)壞疽現(xiàn)象，但表現(xiàn)出雞冠蒼白、眼瞼擴(kuò)張，且因暫時(shí)麻痹及其他并發(fā)癥而出現(xiàn)高死

5、亡率。免疫組化結(jié)果表明，兩種品系雞雞冠組織中均有大量的巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，63品系雞壞疽雞冠組織中有大量CD8+T淋巴細(xì)胞，而72品系雞實(shí)驗(yàn)組雞冠中卻未檢測(cè)到；組織病理學(xué)結(jié)果表明，63品系雞壞疽雞冠表皮侵蝕變薄，結(jié)締組織出現(xiàn)淋巴漿細(xì)胞浸潤，并伴隨異嗜性和組織性蜂窩織炎，72品系雞實(shí)驗(yàn)組雞冠組織表皮輕度侵蝕，且出現(xiàn)嚴(yán)重的淋巴漿細(xì)胞性血管炎；革蘭氏染色結(jié)果表明，63品系雞雞冠壞疽組織中存在革蘭氏陽性菌，而72品系雞雞冠中未檢測(cè)到；熒光定

6、量PCR結(jié)果表明，63品系雞壞疽雞冠中，除了IL-8和iNOS，其他基因幾乎不表達(dá)，而72品系雞雞冠中，IL-6、IL-8、IL-12、IL-18、iNOS和IFN-γ的表達(dá)量均上調(diào)；反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果表明，兩種品系雞的脾組織中，均有meq基因的轉(zhuǎn)錄，而雞冠組織中，只有72品系雞有meq基因的轉(zhuǎn)錄。MD抗性品系雞63和易感品系雞72，在感染MDV后表現(xiàn)出不同的免疫抑制癥狀。其中，63品系雞雖然為MD抗性品系雞，但自然狀態(tài)下，出現(xiàn)了壞疽現(xiàn)象

7、，且感染MDV后，壞疽加重。研究結(jié)果提示我們，人為篩選雞群某種特性（例如MD抗性）的同時(shí)，會(huì)對(duì)雞群的免疫力產(chǎn)生不利影響，使其對(duì)一些病原微生物或環(huán)境的抵抗力減弱。
　　第二部分：15I5×71品系雞皮膚組織對(duì)MDV的免疫反應(yīng)及其機(jī)理。15I5×71品系雞對(duì)MD的易感性與72品系雞相似，1日齡15I5×71品系雞隨機(jī)分為兩組（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組），每組15只。12日齡時(shí)，腹腔注射rMd5-BAC（vvMDV），劑量為2000PFU/只，對(duì)

8、照組不攻毒。攻毒后第26天，雞群出現(xiàn)明顯的免疫抑制癥狀。通過采集皮膚組織，進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析、及熒光定量PCR分析，探究MDV感染導(dǎo)致15I5×71品系雞羽毛囊上皮的免疫反應(yīng)、免疫抑制機(jī)理及免疫逃避機(jī)制。免疫組化結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組雞只羽毛囊上皮細(xì)胞中，病毒大量復(fù)制，輔助T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)量增加，而細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞大量缺失。熒光定量PCR結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組皮膚組織中大部分基因的表達(dá)量均上調(diào)，然而，幾個(gè)重要的免疫相關(guān)基因（如：CD107a

9、、ITGA6、TGF-β、IFN-β）的轉(zhuǎn)錄活性卻降低。盡管整體的基因表達(dá)水平表明，機(jī)體產(chǎn)生了有效的Th1型免疫反應(yīng),但在羽毛囊上皮細(xì)胞中，游離于細(xì)胞外的病毒粒子的復(fù)制不受拘束。由此推測(cè)，MDV對(duì)15I5×71品系雞產(chǎn)生免疫抑制的機(jī)制，是通過下調(diào)CD8的表達(dá)量，來抑制細(xì)胞毒T細(xì)胞的功能，并通過降低細(xì)胞粘附分子的表達(dá)，來阻止細(xì)胞毒性T細(xì)胞的遷移。MDV的感染導(dǎo)致細(xì)胞毒性T細(xì)胞的缺失或者其生物功能的缺乏，使機(jī)體缺少一個(gè)有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)。同