喹賽多脫氧代謝物的毒理學(xué)研究.pdf

1、喹噁啉類藥物(Quinoxalines)是一類具有喹噁啉-1，4-二氧化物基本結(jié)構(gòu)的人工合成的抗菌促生長藥物，主要包括卡巴氧(Carbadox)、喹乙醇(Olaquindox)、喹賽多(Cyadox)、乙酰甲喹(Mequindox)等。之前的研究表明喹噁啉藥物的毒性與脫氧代謝有密切且復(fù)雜的關(guān)系，如喹乙醇雖具有遺傳毒性，但是其脫氧代謝物沒有遺傳毒性，但是另有試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卡巴氧與其脫二氧代謝物均具有致畸變和致癌性。喹賽多與同類藥物相比，安全性高

2、、副作用小、用藥吸收快，作為安全性更高的新研發(fā)藥物，將能夠替代傳統(tǒng)喹噁啉類藥物用于臨床當(dāng)中。為了更全面的檢測喹賽多的安全性，本課題進(jìn)行了喹賽多主要的三種脫氧代謝物N4-脫一氧(Cy2)、N1-脫一氧(Cy10)、N1，4-脫二氧代謝物(Cy1)的毒理性研究，為喹賽多申報(bào)和口后的生產(chǎn)使用提供參考資料。
　　1、急性毒性試驗(yàn)
　　各選用52只雌雄SPF級Wistar大鼠和78只Balb/c小鼠，雌雄各半。由于N1和N4脫一氧代謝

3、物在制備過程中難以分離純化到足夠的大鼠灌胃量，因此大鼠是分別經(jīng)口灌喂N1和N4喹賽多脫一氧混合物(1∶2)以及脫二氧代謝物混懸液染毒，Balb/c小鼠分別經(jīng)口灌喂N1-脫一氧、N4-脫一氧、N1，4-脫二氧代謝物混合液染毒。首先使用上下法(Up and down method)中5000mg/kg劑量水平的限度試驗(yàn)，先將受試物給予雌雄大鼠和小鼠各一只，每只5000mg/kg b.w.，該鼠存活，再將受試物給予另外2只大鼠和小鼠，也都存活

4、，結(jié)果表明，各代謝物在大鼠和小鼠的LD50均大于5000mg/kg，隨后又進(jìn)行了最大給藥法的急性毒性實(shí)驗(yàn)，以測定喹塞多三種代謝物的最大耐受量。結(jié)果表明，Wistar大鼠口服喹賽多脫一氧混合物以及脫二氧代謝物的最大耐受量(MTD)均為6000mg/kgb.w.。N1-脫一氧、N4-脫一氧、N1，4-脫二氧代謝物在Balb/c小鼠的MTD均是6000mg/kg b.w.。喹賽多三種脫氧代謝物的急性毒性分級為無毒。
　　2、遺傳毒性試驗(yàn)

5、
　　細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)試驗(yàn)選用鼠傷寒沙門氏菌株包括TA97a，TA98，TA100，TA102和TA1535，N1-脫一氧代謝物劑量分別為2.5、1.25、0.625、0.312和0.156 mg/皿，N4-脫一氧代謝物劑量分別為1.25、0.625、0.312、0.156和0.078 mg/皿，N1，N4-脫二氧代謝物劑量分別為5、2.5、1.25、0.625和0.312 mg皿，同時(shí)不同菌株設(shè)有相應(yīng)的陽性對照組（其細(xì)菌回復(fù)突變

6、數(shù)均是溶劑對照組的2倍以上）和溶劑對照組(DMSO，416μ L)，在加和不加S9代謝活化系統(tǒng)條件下檢測受試物對5株細(xì)菌的致突變性。試驗(yàn)采用平皿摻入法，計(jì)數(shù)各皿的回復(fù)突變菌落數(shù)，得出各劑量組與陰性對照組回變菌落數(shù)比值。結(jié)果顯示，在加與不加S9代謝活化系統(tǒng)的條件下，三種代謝物在所試驗(yàn)的劑量范圍內(nèi)，所引起各菌株的回變菌落數(shù)與陰性對照組的比值均小于2，結(jié)果均為陰性。說明N1-脫一氧、N4-脫一氧、N1，4-脫二氧代謝物在本試驗(yàn)條件下均無致突變

7、性。
　　小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)選用7-12周齡SPF級的Balb/c小鼠(110只)隨機(jī)分組，每組雌雄各5只，N1-脫一氧、N4-脫一氧、N1，4-脫二氧代謝物的劑量均設(shè)置3組，濃度均為1.25、2.5和5 g/kg b.w.，同時(shí)設(shè)置陰性和陽性對照組(環(huán)磷酰胺，40mg/kgb.w.)。采用30小時(shí)內(nèi)經(jīng)口染毒2次（陽性對照組為一次性腹腔注射），2次給藥間隔24 h，第二次給藥6h后，小鼠脫頸椎處死，采集股骨骨髓制片染色，最后鏡檢

8、。每只動(dòng)物計(jì)嗜多染紅細(xì)胞(PCE)1000個(gè)，計(jì)算含微核的嗜多染紅細(xì)胞(MNPCE)數(shù)。在計(jì)數(shù)PCE時(shí)，須要計(jì)數(shù)所見到的正染紅細(xì)胞(NCE)，并求出PCE/NCE的比值。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，N1-脫一氧、N4-脫一氧、N1，4-脫二氧代謝物的各劑量組微核發(fā)生率沒有顯著上升（p＞0.05）。說明N1-脫一氧、N4-脫一氧、N1，4-脫二氧代謝物在體內(nèi)微核試驗(yàn)的結(jié)果均是陰性，不具有體內(nèi)致突變性。
　　體外細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)選擇

9、中國倉鼠肺成纖維細(xì)胞(V79)作為該試驗(yàn)的對象，N1-脫一氧代謝物的劑量分別為30、15和7.5μg/mL; N4-脫一氧代謝物劑量分別為17、8.5和4.25μg/mL; N1，4-脫二氧代謝物的劑量分別為76、38和19μg/mL，同時(shí)設(shè)陰性和陽性對照組(不加S9的為絲裂霉素(MMC)0.2μg/mL和加S9的為環(huán)磷酰胺(CP)50.0μg/mL)。試驗(yàn)分別在加和不加S9代謝活化系統(tǒng)的條件下進(jìn)行。在不加S9時(shí)，受試物分別作用6h、1

10、2h和18h;在加S9的條件時(shí)，受試物作用6h，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后制片。各劑量組觀察200個(gè)中期分裂相細(xì)胞，計(jì)算其中的細(xì)胞染色體畸變率。試驗(yàn)結(jié)果顯示，N1-脫一氧、N4-脫一氧、N1，4-脫二氧代謝物的各自劑量組在加與不加S9的細(xì)胞畸變率同陰性對照組比較，均沒有顯著性增高(p＞0.05)，且畸變率均小于5％，判定結(jié)果為陰性。表明N1-脫一氧、N4-脫一氧、N1，4-脫二氧代謝物在本試驗(yàn)中不會引起V79細(xì)胞染色體畸變。
　　3、大鼠

11、90天喂養(yǎng)試驗(yàn)
　　選用6-8周齡SPF級Wista大鼠(280只)作為試驗(yàn)動(dòng)物，通過混飼方式染毒13周，最高劑量組以及空白對照組有2周恢復(fù)期，喹賽多脫一氧混合物和脫二氧代謝物劑量設(shè)置均為0、50、150和2500 mg/kg飼料，另外設(shè)喹賽多2500 mg/kg組為對照組?？瞻讓φ战M、喹賽多2500 mg/kg組、喹賽多脫一氧混合物和喹賽多脫二氧代謝物的2500 mg/kg組每組雌雄各20只;脫一氧混合物和脫二氧代謝物的50和1

12、50mg/kg飼料組每組雌雄各15只，飼養(yǎng)條件符合國際動(dòng)物福利規(guī)定。每日觀察并在每周固定時(shí)間對大鼠體重以及飼料剩余稱量，計(jì)算大鼠的攝食量和飼料利用率。分別在試驗(yàn)45天和90天宰殺各組雌雄大鼠各5只和10只，取血樣進(jìn)行血液學(xué)和血清生化指標(biāo)檢驗(yàn)，尸體作病理剖檢，主要臟器稱重并制作組織病理學(xué)檢查。90天后剩余的各組大鼠飼喂空白飼料，兩周恢復(fù)期后作上述同樣處理。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在喹賽多脫一氧代謝物混合物和脫二氧代謝物以及喹賽多的2500 mg/k

13、g飼料組的雌雄大鼠體重顯著低于空白組(p＜0.05），喹賽多脫二氧代謝物2500 mg/kg飼料組雄性大鼠肝臟、肺臟、腎臟、腦和睪丸（帶附睪）的臟體比顯著大于空白對照組(p＜0.05）;喹賽多2500 mg/kg飼料組的雄性大鼠的肺臟、腦和睪丸（帶附睪）的臟體比顯著大于空白對照組(p＜0.05);喹賽多脫二氧代謝物2500 mg/kg飼料組雌性大鼠肝臟、腦和脾臟的臟體比顯著小于空白對照組(p＜0.05);另外，喹賽多2500 mg/kg

14、組雌性大鼠的腦臟體比也顯著小于空白對照組(p＜0.05）。血常規(guī)和血清生化檢驗(yàn)結(jié)果顯示在雄性大鼠中，與空白組相比，喹塞多及其脫二氧代謝物2500 mg/kg飼料組的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平顯著升高(p＜0.05）;在雌性大鼠中，喹塞多2500 mg/kg組及其脫二氧代謝物150 mg/kg、2500 mg/kg飼料組的白蛋白(ALB)、堿性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基

15、轉(zhuǎn)移酶(AST)水平顯著升高(p＜0.05)。組織病理學(xué)檢查的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喹賽多以及其脫一氧代謝物混合物和脫二氧代謝物的2500 mg/kg高劑量組大鼠的主要病理變化是肝臟門管區(qū)出現(xiàn)不同程度的炎性細(xì)胞浸潤，脫一氧代謝物混合物高劑量組大鼠每天實(shí)際攝入藥物量分別為174.89±67.33 mg/kg b.w.，脫二氧代謝物高劑量組大鼠是183.49±70.86 mg/kgb.w.，喹賽多每天的實(shí)際攝入藥物量是193.44±73.32 mg/k

16、g b.w.。綜合各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果表明，脫一氧代謝物混合物以及脫二氧代謝物對Wistar大鼠亞慢性毒性作用的靶器官為肝臟，脫一氧代謝物混合物的最大未觀察到毒害作用劑量(NOAEL)為10.51mg/kg b.w.; N1,N4-脫二氧代謝物的NOAEL為10.62 mg/kg b.w.。
　　本課題完成了喹賽多三種脫氧代謝物的急性毒性、遺傳毒性、亞慢性毒性試驗(yàn)，得到了脫一氧代謝物的混合物、脫二氧代謝物的NOAEL，確定了喹賽多脫氧代謝