豬偽狂犬病免疫膠體金鑒別診斷試劑盒的研制.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)又叫奧葉茲基氏病(Aujeszkysdisease，AD)，是由偽狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)又名豬皰疹病毒Ⅰ型(SuiserpesvirusⅠ)所引起的多種家畜、野生動物、伴侶動物和實驗動物的一種急性傳染病。在自然條件下，本病最常見于豬、牛、羊、犬、貓和鼠類。臨床上多以發(fā)熱、騷癢(豬除外)和急性腦脊髓炎為主要癥狀。豬和鼠是此病的主要自然宿主和傳染源。該病具有高度的傳

2、染性，一旦在豬群中出現(xiàn)，將很快通過空氣或接觸傳染給其它豬只和豬場。近年來的研究表明偽狂犬病病毒還能通過乳汁和生殖道感染。特別是在規(guī)?；?、集約化、現(xiàn)代化的高密度養(yǎng)豬地區(qū)，偽狂犬病病毒可在豬群間不斷傳播，危害尤為嚴重，除引起死亡和繁殖障礙外，該病還嚴重影響豬只的生長發(fā)育和生產(chǎn)性能，它不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失(在美國每年僅豬偽狂犬病造成的損失就達數(shù)百萬美元)，而且它的存在使整個養(yǎng)殖業(yè)時刻面臨著嚴重的威脅。PRV歸屬于α皰疹病毒亞科。目

3、前世界上包括我國在內(nèi)廣泛使用的預(yù)防此病的疫苗均帶有g(shù)E基因缺失的表型特征。本實驗根據(jù)PRVMin-A株gE基因序列，參考已發(fā)表的關(guān)于PRVgE蛋白抗原性表位的相關(guān)報道，利用PCR方法擴增了PRVgE基因不含信號肽和跨膜區(qū)的部分，并克隆到原核表達載體pGEX-6p-1，獲得的重組質(zhì)粒命名為pGEX-gE。用pGEX-gE轉(zhuǎn)化受體菌BL21，用誘導(dǎo)劑IPTG以不同濃度進行誘導(dǎo)。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析證實克隆的部分gE基因獲得了表達，融

4、合表達產(chǎn)物大小約為63KD，并在終濃度為0.6mmol/L的IPTG誘導(dǎo)下，3.5h其表達量達到高峰。Wéstern-blot分析證實表達的重組gE蛋白具有抗原反應(yīng)活性。將表達產(chǎn)物利用親和層析法純化后作為抗原?！”驹囼炓罁?jù)目前國內(nèi)所應(yīng)用的偽狂犬疫苗均是gE基因缺失的表型特征。而野毒感染的PRY都含有g(shù)E基因這一事實，建立了一種快速、簡易的分子鑒別診斷方法——鑒別膠體金免疫層析法(GICA)，用于豬血清中PRV抗體的監(jiān)測，區(qū)分疫苗免疫的

5、動物和自然感染PRV的動物。利用原核表達方法制備偽狂犬gE蛋白抗原，用全病毒抗原包被膠體金。依次將豬偽狂犬標準陽性血清、gE蛋白抗原和偽狂犬全病毒抗原標記在硝酸纖維素(NC)膜上制備成免疫膠體金檢測板。檢測時血清中PRV抗體與金標抗原結(jié)合，沿著NC膜層析移動，與NC膜上相應(yīng)的配體結(jié)合后形成肉眼可見的紫紅色斑點。經(jīng)特異性交叉試驗、阻斷試驗驗證該方法特異性、靈敏度較高，利用哈獸研偽狂犬疫苗生產(chǎn)組提供的豬PRV高免血清進行靈敏度測試，并用間接