22629.eteck88abk88ad菌毛操縱子fae全基因的克隆、表達(dá)及l(fā)t提升細(xì)菌黏附性能的初步研究

1、E郁磊：ETECK88ab／K88ad菌毛操縱子fae全基I天lLT提升細(xì)菌黏附性能的初步研究lIIIIIIIIIIIlllIIIlUIY20498421ETECK88ab／K88ad菌毛操縱子fae全基因的克隆、表達(dá)及LT提升細(xì)菌黏附性z月‘匕l(fā)c的初步研究專業(yè)：微生物學(xué)研究生：郁磊導(dǎo)師：朱國強(qiáng)教授中文摘要產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoliETEC)是導(dǎo)致斷奶前仔豬腹瀉和死亡的主要病原之一。

2、該病原菌含有兩種致病因子：菌毛粘附素和腸毒素。菌毛粘附素與上皮細(xì)胞微絨毛的相互作用使ETEC能定殖于仔豬小腸。首次從腹瀉仔豬分離鑒定的ETEC菌毛粘附素為K88菌毛。大多數(shù)從腹瀉仔豬分離到的ETEC菌株表達(dá)有K88、K99、987P或F41菌毛粘附素；其中，K88是最流行的菌毛祜附素。近期的研究認(rèn)為，細(xì)菌表達(dá)熱敏腸毒素LT的功能除了導(dǎo)致宿主腹瀉外，對小腸上皮細(xì)胞的細(xì)菌黏附具有促進(jìn)作用。因此，本研究將集中如下兩部分：一、克隆、表達(dá)ETEC

3、K88ab／K88ad菌毛基因，并比較K88菌毛三種血清型的野生菌和重組菌對豬小腸上皮細(xì)胞的黏附差異；二、克隆、表達(dá)LT毒素基因，并探索LT毒素的表達(dá)對小腸上皮細(xì)胞的細(xì)菌黏附性能的影響。上述研究旨在為深入全面地研究ETEC的毒力因子奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)分如下兩部分：研究一：利用PCR技術(shù)，以產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(ETEC)K88ab標(biāo)準(zhǔn)株C83901和K88ad標(biāo)準(zhǔn)株C83903基因組DNA為模板擴(kuò)增出編碼K88菌毛操縱子fae基因，大小約79K

4、b。將其克隆入表達(dá)質(zhì)粒載體pBR322，經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化、瓊脂糖電泳鑒定，構(gòu)建和篩選出含J下確插入fae操縱子基因的pBRK88ab和pBRK88ad重組質(zhì)粒。進(jìn)一步將上述重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入不含任何菌毛的大腸桿菌SE5000株。該重組菌可分別和鼠抗重組k88菌毛多抗血清和鼠抗K88菌毛單克隆抗體產(chǎn)生凝集反應(yīng)，在電鏡下觀察到重組菌表面大量表達(dá)K88菌毛。用熱抽提法提取其體外表達(dá)的K88ab和K88ad菌毛，經(jīng)SDSPAGE電泳和考馬斯