17057.利用原生質(zhì)技術(shù)選育耐氧德氏乳桿菌菌株的研究

1、獨創(chuàng)性l聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：奎西時間：)DJ)年6月5日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，

2、即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：奎函時間：)DQ年多月5日第一導(dǎo)師簽名：盆盛：壅時間：年月日摘要原生質(zhì)體技術(shù)已成為工業(yè)微生物育種的有效手段，包括原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化育種、原生質(zhì)體融合育種、原生質(zhì)體誘變育種、原生質(zhì)體再生育種及其他原生質(zhì)體

3、育種等。本文利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和單親滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)選育耐氧性能提高的德氏乳桿菌保加利亞亞種菌株，其結(jié)果如下：起始菌株德氏乳桿菌FQ菌株是革蘭氏陽性菌，細(xì)胞壁致密，所以在原生質(zhì)體的制備過程中，采用質(zhì)量濃度適合的溶菌酶和變?nèi)芫毓餐饔?。酶濃度、酶解時間和酶解方式會影響原生質(zhì)體的形成和再生，因此，本文采用不同質(zhì)量濃度的溶菌酶和變?nèi)芫卦?7。C下恒溫酶解及超聲處理德氏乳桿菌FQ菌株，其原生質(zhì)體的形成率和再生率隨著變?nèi)芫刭|(zhì)量濃度的增加而

4、逐漸增大，當(dāng)變?nèi)芫睾腿芫附K質(zhì)量濃度分別為101ag／mL和1mg／mL和超聲酶解120min時，形成率和再生率的乘積最大，形成率和再生率分別為9999％5fH493％，酶濃度過高原生質(zhì)體的再生率反而降低。用最適酶質(zhì)量濃度為10pg／mL變?nèi)芫睾?mg／mL溶菌酶，在37℃下恒溫酶解并超聲處理30rain、60min、90rain、120rain，結(jié)果表明：原生質(zhì)體形成率為9999％，沒有隨酶解時間的增加而增大；處理90rain，達(dá)

5、到最大再生率636％。因此，德氏乳桿菌FQ菌株原生質(zhì)體再生的最適條件為：1099／mL變?nèi)芫睾?mg／mL溶菌酶，在37℃下恒溫酶解并超聲處理90min。再生培養(yǎng)基的組成是影響原生質(zhì)體再生的關(guān)鍵因素，六種雙層再生培養(yǎng)基中，雙層再生培養(yǎng)基II(RMII)是德氏乳桿菌FQ菌株原生質(zhì)體的最適再生培養(yǎng)基，再生率可達(dá)到1059％，再生率大小為：RMIIRMIRMⅡIRMⅣ，而RMV和RMⅥ上原生質(zhì)體不能再生。為獲得耐氧型德氏乳桿菌，本文利用原生

6、質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)將乳酸乳球菌FC菌株的質(zhì)粒pFL010及其對照菌株乳酸乳球菌FL菌株的質(zhì)粒pNZ8148轉(zhuǎn)入德氏乳桿菌FQ菌株，結(jié)果表明：37。C下，在含有1099／mL變?nèi)芫睾?mg／mL溶菌酶溶液中超聲處理90min制備德氏乳桿菌FQ菌株原生質(zhì)體，在PEG60004009／L、轉(zhuǎn)化溫度20℃、轉(zhuǎn)化時問5min的條件下進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，連續(xù)傳5代，得到兩株轉(zhuǎn)化子，分別命名為QC和QL。轉(zhuǎn)化子Qc和OL靜置培養(yǎng)下的細(xì)胞密度均高于德氏乳桿菌