Zn-金屬硫蛋白間接競(jìng)爭(zhēng)型ELISA的建立與應(yīng)用.pdf

1、ELISA以其快速、準(zhǔn)確、安全、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)而成為定量測(cè)定生物體內(nèi)微量有機(jī)物的理想方法.該實(shí)驗(yàn)的目的就是為了建立一套快速、有效、方便并能定量測(cè)定豬體組織中MT含量的ELISA法,為動(dòng)物科學(xué)中的研究和應(yīng)用提供MT的定量測(cè)定技術(shù).1.豬MT抗小鼠抗血清的制備:用戊二醛法將純品Zn-MT與載體蛋白(BSA)偶聯(lián)后,作為人工抗原,對(duì)昆明小鼠皮下注射.首次免疫時(shí)抗原中MT量分別為8ug/只、16ug/只、32ug/只、64ug/只、128ug/只;

2、加強(qiáng)免疫時(shí)所用抗原量依次加倍.前3次免疫時(shí)采用的是弗氏完全佐劑乳化,后3次免疫采用弗氏不完全佐劑乳化.兩批小鼠加強(qiáng)免疫的時(shí)間隔分別為10日和14日.用免疫雙擴(kuò)散方法測(cè)定抗血清效價(jià).得出以下結(jié)論:當(dāng)首次免疫抗原中MT的量為16-32ug/只,每次加強(qiáng)免疫時(shí)抗原量加倍,加強(qiáng)免疫間隔時(shí)間為10日時(shí),其免疫效果較佳,可使大部分小鼠抗血清效價(jià)達(dá)到1:16以上.2.抗體的純化及鑒定:將效價(jià)達(dá)到1:16以上的MT小鼠抗血清用飽和硫酸銨鹽析法濃縮出γ-

3、球蛋白,然后用DEAE-Sephadex A50層析柱分離提純IgG.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)洗脫液pH值為7.4時(shí)洗脫第一峰即為純化的IgG,用不連續(xù)緩沖系統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠濃度梯度電泳鑒定層析洗脫下的IgG達(dá)到電泳純.對(duì)純化后的IgG進(jìn)行辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記,用直接ELISA鑒定其為MT的特異性抗體.3.ELISA的建立:運(yùn)用固相抗原間接非競(jìng)爭(zhēng)型ELISA和固相抗原間接競(jìng)爭(zhēng)型ELISA檢測(cè)豬體組織中部分樣品MT的含量,結(jié)果表明:用間接非競(jìng)爭(zhēng)型ELIS

4、A測(cè)定樣品時(shí)其結(jié)果不夠穩(wěn)定,同一樣品所對(duì)應(yīng)的0D值相差較大,此方法僅適合于樣品中MT定性檢測(cè);采用間接競(jìng)爭(zhēng)型ELISA測(cè)定樣品,OD值比較穩(wěn)定.用方陣滴定法確定了間接競(jìng)爭(zhēng)型ELISA的各項(xiàng)具體條件:抗原最佳包被濃度為6.25ug/ml,一抗(鼠抗豬)使用適宜濃度為50ug/ml,酶標(biāo)抗體(山羊抗小鼠)的使用濃度為1/8000倍,反應(yīng)時(shí)間為3hr.用標(biāo)準(zhǔn)MT,采用間接競(jìng)爭(zhēng)型ELISA方法擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=105×2(22.32