膽管癌67kDa層粘素受體調(diào)控Fas配體表達的分子機制研究.pdf

1、研究背景:Fas配體(FasL)是一種分子量約4萬道爾頓的跨膜蛋白,屬于腫瘤壞死因子超家族,當其與受體Fas結(jié)合后能夠啟動細胞凋亡。目前,大量研究顯示:FasL不但在激活的T淋巴細胞上表達,而且在多種腫瘤細胞中表達,在人膽管癌細胞中,FasL也呈過表達。我們的研究及其它一些研究均顯示,當高表達FasL的腫瘤細胞與Fas+的T淋巴細胞共培養(yǎng)時,可誘導Fas+的T淋巴細胞發(fā)生凋亡。這些研究結(jié)果提示腫瘤細胞的免疫逃逸與腫瘤細胞表達FasL有關(guān)

2、。然而,關(guān)于腫瘤細胞FasL表達的信號調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控,目前研究仍不透徹。我們以往的研究顯示在人膽管癌細胞中67kDa的層粘素受體(67kDa laminin receptor,67-kDa LNR)過表達可誘導FasL的表達,但其信號調(diào)節(jié)及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制目前不清楚。
　　 67 kDa層粘素受體(67kDa laminin receptor,67-kDa LNR)廣泛存在于上皮細胞、內(nèi)皮細胞、周圍神經(jīng)細胞、巨噬細胞及大部分腫瘤細胞

3、表面,結(jié)合位點為LNβ1鏈的YIGSR序列。67-kDa LNR的高表達,可使癌細胞與基底膜的黏附力增強,有利于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。67-kDa LNR與LN的結(jié)合誘導了一系列跨膜信號傳導系統(tǒng)的變化,最近的一項研究發(fā)現(xiàn),層粘連蛋白的信號通路參與了有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK的)級聯(lián)反應。這些結(jié)果提示:67-kDa LNR表達上調(diào)可能激活MAPK信號轉(zhuǎn)導通路,且MAPK/ERK1/2被激活后,可將信號傳遞到細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,從而增加與D

4、NA的結(jié)合,促進和調(diào)節(jié)有關(guān)的基因表達。而腫瘤細胞67-kDa LNR激活MAPK信號轉(zhuǎn)導通路是否可調(diào)節(jié)腫瘤細胞FasL的表達目前還不清楚。
　　 在T淋巴細胞中,FasL基因表達是受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控,包括NF-KB,AP-1,c-Myc等。然而,在腫瘤細胞中,FasL的轉(zhuǎn)錄調(diào)控受哪些轉(zhuǎn)錄因子的影響目前仍不清楚。C-Myc是一種原癌基因,與腫瘤的分化和發(fā)展密切相關(guān),它和異二聚體Max一起形成轉(zhuǎn)錄因子復合體,介導了許多腫瘤生長基因的表達

5、。而且,c-Myc不但可以引起細胞的增殖,且可以誘導凋亡,而其誘導凋亡的作用與Fas和FasL的表達有關(guān),Brunner etal.揭示了c-Myc通過直接與FasL啟動子相互作用,誘導活化T細胞FasL表達。在腫瘤細胞中,c-Myc是否可以調(diào)控FasL的表達目前還知之甚少。
　　 基于以上研究結(jié)果和思路,所以在本實驗中,我們主要應用MAPK/ERKkinase(MEK)特異抑制劑PD98059,來觀察腫瘤細胞67-kDa LN

6、R能否通過MAPK/ERK1/2信號通路,影響轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的活性,從而調(diào)控人膽管癌細胞FasL的表達,進而影響Jurkat T細胞的凋亡。
　　 來材料與方法:
　　 1.用RT-PCR和Western-bolt檢測PD98059處理組及未處理組人膽管癌細胞(QBC939)中c-Myc、p-c-Myc和FasL的表達。
　　 2.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染c-Myc干擾質(zhì)粒至人膽管癌細胞,用RT-PCR和West

7、ern-bolt檢測c-Myc和FasL的表達。
　　 3.構(gòu)建含F(xiàn)asL啟動子及c-Myc結(jié)合位點(-127/-121)的FasL啟動子的突變體的熒光素酶報告基因質(zhì)粒,分別與pRL-TK表達質(zhì)粒一起瞬時轉(zhuǎn)染人膽管癌細胞,檢測熒光素酶相對活性,比較PD98059處理組及PD98059未處理組人膽管癌細胞FasL啟動子活性的變化情況;比較c-Myc結(jié)合位點突變前后的FasL啟動子活性變化。
　　 4.染色質(zhì)免疫共沉淀(CH

8、IP)技術(shù)分析p-c-Myc與活體人膽管癌細胞中FasL基因啟動子的結(jié)合情況。
　　 5.建立人膽管癌細胞與人Jurkat T細胞Transwell(R)小室旁分泌共培養(yǎng)模型,用TUNEL法檢測膽管癌細胞PD98059處理組及PD98059未處理組對Jurkat T細胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.PD98059處理組人膽管癌細胞(QBC939細胞)磷酸化c-Myc(p-c-Myc)和FasL的表達均明顯

9、降低,而c-Myc未見明顯變化;c-Myc干擾組膽管癌細胞c-Myc和FasL的表達均明顯降低。
　　 2.構(gòu)建包含F(xiàn)asL啟動子的PGL3-FasL-pro熒光素酶報告質(zhì)粒并有c-Myc結(jié)合位點突變的PGL3-FasL-proM熒光素酶報告質(zhì)粒,均經(jīng)酶切及測序鑒定,表明PGL3-FasL-pro和PGL3-FasL-proM熒光素酶報告載體質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　 3.運用熒火蟲酶活性分析技術(shù)證實PD98059處理組人膽管

10、癌細胞(QBC939細胞)熒光素酶活性(FasL基因啟動子活性)與對照組相比明顯下降;c-Myc干擾組及突變體組熒光素酶活性(FasL基因啟動子活性)與對照組相比分別下降約80％和70％。
　　 4.用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)證實了在人膽管癌細胞(QBC939細胞)中,p-c-Myc與FasL基因啟動子存在結(jié)合關(guān)系。
　　 5.人膽管癌細胞(QBC939細胞)與Jurkat T細胞共培養(yǎng)后,Jurkat T細胞的凋亡指數(shù)明顯

11、增加;而PD98059處理人膽管癌細胞(QBC939細胞)后,JurkatT細胞的凋亡指數(shù)明顯降低。
　　 結(jié)論:
　　 1.人膽管癌細胞(QBC939細胞)中,MAPK-ERK是67kDa層粘素受體(67-kDaLNR)誘導FasL的表達進而誘導Jurkat T細胞凋亡的主要信號通路之一。
　　 2.人膽管癌細胞(QBC939細胞)中,67-kDa LNR誘導增強FasL基因啟動子的活性有賴于轉(zhuǎn)錄因子c-Myc