洋金花治療銀屑病有效部位的化學成分及作用機理研究.pdf

1、洋金花為茄科植物白曼陀羅DaturametelL.的干燥花，又名曼陀羅花、風茄花、山茄子、大顛茄和白花曼陀羅等。洋金花生理活性較強，藥用歷史悠久，應用十分廣泛?！吨袊幍洹?005版記載其性味辛、溫，有小毒；具平喘止咳、鎮(zhèn)痛解痙、麻醉之功效。近年來臨床應用洋金花制劑治療銀屑病取得了顯著的治療效果，為了深入闡明洋金花治療銀屑病的有效成分及其作用方式和作用機制，本文進行了系統(tǒng)的研究。 本文經過長期反復的摸索，最終采用葡聚糖凝膠(Se

2、phadexLH-20)柱色譜以水-甲醇溶劑系統(tǒng)成功地對洋金花治療銀屑病的有效部位進行了分離。從洋金花治療銀屑病有效部位中得到洋金花醉茄甾內酯類組分(以下簡稱洋金花醉茄甾內酯類組分)和洋金花黃酮類組分(以下簡稱洋金花黃酮類組分)，其中洋金花黃酮類組分占有效部位總量的53％以上。 通過硅膠、ODS、SephadexLH-20等柱色譜和HPLC等手段，從洋金花醉茄甾內酯類組分和洋金花黃酮類組分中分離出10種單體化合物，采用UV、IR

3、、1H-NMR、13C-NMR、1H-1HCOSY、HSQC、HMBC和NOESY等1D及2D-NMR波譜學測試技術，并結合ESI-MS、FAB-MS等質譜技術對分離獲得的10種單體化合物進行了結構鑒(確)定，其中有2種黃酮類化合物和8種醉茄甾內酯類化合物，它們分別被命名為山柰酚3-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1→2)-β-D-葡萄吡喃糖基-7-O-α-L-鼠李吡喃糖苷(Kaempferol3-O-β-D-glucopyranosyl(1

4、→2)-β-D-glucopyranosyl-7-O-α-L-rhamnopyranoside)；山柰酚3-O-α-L-鼠李吡喃糖基(1→6)-β-D-葡萄吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖苷(Kaempferol3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→6)-β-D-glucopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranoside)；洋金花苷B(DaturametelosideB)；洋金花苷C(Daturame

5、telosideC)；WithametelinC；洋金花苷F(DaturametelosideF)；洋金花苷I(DaturametelosideI)；洋金花素K(DaturametelineK)；洋金花素L(DaturametelineL)；洋金花素M(DaturametelineM)。在這10種化合物中，確定有3種醉茄甾內酯類化合物為新化合物，分別是洋金花素K(DaturametelineK)；洋金花素L(Daturameteline

6、L)；洋金花素M(DaturametelineM)。 為了深入研究洋金花治療銀屑病有效成分的種類和數(shù)目，本文采用3種與銀屑病相關的體外模型對洋金花有效部位、洋金花醉茄甾內酯類組分、洋金花黃酮類組分以及洋金花苷B和洋金花苷C進行了探討。 在DMSO誘導HaCaT細胞活性降低模型中，應用噻唑藍(MTT)法和乳酸脫氫酶(LDH)活性測定法觀察洋金花有效部位及其組分對DMSO損傷HaCaT細胞的活性變化情況。結果表明，20-80

7、μg/mL洋金花有效部位呈劑量依賴性地增加細胞活性；進一步研究發(fā)現(xiàn)，洋金花醉茄甾內酯類組分(30-240μg/mL)對DMSO的細胞損傷作用無明顯影響，而洋金花黃酮類組分在5-20μg/mL的濃度內呈劑量依賴性地保護DMSO對HaCaT細胞的損傷作用。對DMSO損傷人永生化表皮角質形成細胞具有保護作用的可能是洋金花有效部位及其黃酮類組分。 在IFN-γ誘導HaCaT細胞凋亡模型中，應用噻唑藍(MTT)法和乳酸脫氫酶(LDH)活性

8、測定法觀察洋金花有效部位及其組分對γ-干擾素誘導HaCaT細胞的活性改變情況；應用Hoechst33342染色法和流式細胞儀(FCM)觀察洋金花有效部位及其組分對γ-干擾素誘導HaCaT細胞凋亡的影響；應用蛋白質免疫印跡(Westernblotting)方法檢測洋金花有效部位及其組分對銀屑病直接相關蛋白K17表達的影響。結果表明，25-50μg/mL洋金花有效部位對凋亡的HaCaT細胞有明顯保護作用，且呈劑量依賴性地增加細胞活性；進一步

9、研究顯示醉茄甾內酯類組分(21.5-86μg/mL)對IFN-γ的細胞凋亡作用無明顯影響，而黃酮類組分在5-10μg/mL的濃度范圍內呈劑量依賴性地增加細胞活性。應用Hoechst33342染色，熒光顯微鏡觀察后可見到凋亡細胞的細胞核或細胞質內濃染致密的顆粒快狀熒光或熒光碎片，25μg/mL洋金花有效部位和5μg/mL黃酮類組分可以明顯降低凋亡碎片的熒光強度，而醉茄甾內酯類組分并不能有效地抑制細胞凋亡的發(fā)生。應用流式細胞儀檢測后可以得到

10、同樣結果，再觀察HaCaT細胞細胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)洋金花有效部位、醉茄甾內酯類組分和黃酮類組分均沒有改變凋亡細胞的細胞周期。應用Westernblotting檢測K17蛋白的表達，結果表明12.5-50μg/mL洋金花有效部位和2.5-10μg/mL黃酮類組分可有效的抑制IFN-γ刺激產生的K17基因的翻譯水平，使K17蛋白的表達量降低，而醉茄甾內酯類組分在此模型中并無明顯藥理活性。洋金花有效部位和黃酮類組分在γ-干擾素誘導的HaCaT

11、凋亡模型中顯示出明顯的抗細胞凋亡的藥理活性，其作用機理可能與改善細胞的凋亡狀態(tài)和抑制K17蛋白的表達有關。 在EGF誘導人永生化表皮角質形成細胞增殖的模型中，應用噻唑藍(MTT)法和乳酸脫氫酶(LDH)活性測定法觀察洋金花有效部位及其組分、洋金花苷B和洋金花苷C對EGF誘導HaCaT細胞的活性改變情況；應用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察洋金花醉茄甾內酯類組分、洋金花苷B和洋金花苷C對EGF誘導產生的K17蛋白熒光強度的影響；同時應用激

12、光掃描共聚焦顯微鏡還觀察了醉茄甾內酯類組分、洋金花苷B和洋金花苷C對增殖細胞胞漿內[Ca2+]i的影響。結果表明，洋金花醉茄甾內酯類組分(43-86μg/mL)、洋金花苷B(3-30μg/mL)和洋金花苷C(3-30μg/mL)均可以劑量依賴性地降低HaCaT細胞的活性；進一步研究得知洋金花有效部位(12.5-50μg/mL)和黃酮類組分(2.5-10μg/mL)對增殖的HaCaT細胞無明顯抑制作用。應用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，EGF

13、可以使K17蛋白的熒光強度明顯增強，醉茄甾內酯類組分、洋金花苷B和洋金花苷C均可以使增強的K17蛋白熒光強度下降，而洋金花有效部位和黃酮類組分并不能改變K17的熒光強度；應用激光掃描共聚焦顯微鏡在0-20h各個時間點觀察增殖細胞胞漿內[Ca2+]i的變化，結果顯示醉茄甾內酯類組分、洋金花苷B和洋金花苷C在作用于HaCaT細胞16-20h后可以明顯降低[Ca2+]i。醉茄甾內酯類組分、洋金花苷B和洋金花苷C在表皮生長因子(EGF)誘導人永

14、生化表皮角質形成細胞增殖的模型中顯示出很好的抑制作用，其作用機理可能與抑制K17蛋白的表達和降低細胞內[Ca2+]i有關。 綜上所述，洋金花治療銀屑病有效部位主要包括黃酮類組分和醉茄甾內酯類組分。在銀屑病相關的細胞模型上，發(fā)現(xiàn)黃酮類組分對DMSO和INF-γ所致細胞損傷和凋亡具有明顯的細胞保護作用，而醉茄甾內酯類組分，洋金花苷B以及洋金花苷C對EGF誘導細胞過度增殖顯示出明顯的抑制作用。對HaCaT細胞具有凋亡誘導作用的INF-

15、γ和具有增殖促進作用的EGF均可使HaCaT細胞K17過表達，而洋金花有效部位中的黃酮類組分和醉茄甾內酯類組分對不同狀態(tài)下的HaCaT細胞K17的過表達分別具有明顯的抑制作用。這些實驗結果表明，洋金花治療銀屑病有效部位中的黃酮類組分和醉茄甾內酯類組分對銀屑病相關的病理生理改變的干預作用并不完全相同，同一有效部位不同的有效組分對表皮角質形成細胞消亡和增殖病理生理過程具有不同的藥理活性可能是洋金花有效部位治療銀屑病的特點之一，充分體現(xiàn)了中藥