非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因LongSAGE篩查的初步研究.pdf

1、目的：近年來，肺癌的發(fā)病率逐年上升。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌所有病例的80％以上。由于常發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，肺癌患者的5年生存率只有15％左右。雖然大多數(shù)腫瘤是單克隆起源的，但由于腫瘤的遺傳學(xué)不穩(wěn)定性和靶器官的選擇作用，腫瘤常常表現(xiàn)為一個不斷變異的群體，有些瘤細(xì)胞亞群得以雜在靶器官優(yōu)勢生長，獲得轉(zhuǎn)移表型。在這個過程中，有大量基因的表達(dá)發(fā)生著改變。與原發(fā)瘤細(xì)胞相比，一部分癌細(xì)胞可能被

2、賦予一些特殊的生物學(xué)性狀而具有非凡的轉(zhuǎn)移能力。尋找這些差異表達(dá)的基因，對于闡明腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制，乃至設(shè)計相應(yīng)的阻斷靶點(diǎn)，最終抑制轉(zhuǎn)移，具有十分重要的理論意義及臨床應(yīng)用前景。本實驗利用穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的人巨細(xì)胞肺癌細(xì)胞株95D，建立肺癌裸鼠皮下移植及肺轉(zhuǎn)移模型，用熒光激活的流式細(xì)胞分選術(shù)(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)分別純化原發(fā)灶和肺部轉(zhuǎn)移灶癌細(xì)胞，利用近年來迅速發(fā)展的

3、一種快速分析基因表達(dá)信息的技術(shù)---基因表達(dá)系列分析(Serial Analysis of Gene Expression.SAGE)，從全基因組水平對裸鼠肺癌轉(zhuǎn)移模型皮下原發(fā)灶和肺部轉(zhuǎn)移灶的癌細(xì)胞的基因表達(dá)譜進(jìn)行比較和分析，為尋找在肺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)生改變的基因做出嘗試，為進(jìn)一步研究肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制打下基礎(chǔ)。 方法: 1.利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將GFP導(dǎo)入人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株95D，經(jīng)過G418篩選和克隆化培養(yǎng)，用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞

4、儀檢測GFP基因在癌細(xì)胞體外的表達(dá)，繪制細(xì)胞生長曲線，檢測細(xì)胞貼壁率等，觀察穩(wěn)定表達(dá)GFP的癌細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為有無改變。 2.95D/GFP-1細(xì)胞接種裸鼠背部皮下，成瘤2月后，常規(guī)麻醉裸鼠，熒光體視鏡結(jié)合解剖觀察皮下原發(fā)灶腫瘤及遠(yuǎn)處臟器，尋找轉(zhuǎn)移病灶，并利用FACS法純化病灶腫瘤細(xì)胞。 3.利用SAGE技術(shù)，建立皮下原發(fā)病灶和肺部轉(zhuǎn)移病灶腫瘤細(xì)胞表達(dá)序列標(biāo)簽(expression sequence tags，EST

5、)文庫，對照美國國立生物技術(shù)信息中心(National Centerof Biotechnolgy Information，NCBI)的SAGEMAP數(shù)據(jù)庫，獲得對應(yīng)基因，比較兩個文庫尋找差異基因。 結(jié)果: 1.攜帶GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒有效感染95D細(xì)胞，篩選出一株能穩(wěn)定、高效、持久地表達(dá)GFP且生物學(xué)特性無明顯改變的細(xì)胞株95D/GFP-1。 2.95D/GFP-1接種至裸鼠皮下后，2周左右成瘤，2月后可發(fā)生淋巴

6、結(jié)、肺部、肝臟的自發(fā)性轉(zhuǎn)移。皮下腫瘤原發(fā)病灶在熒光體視鏡下可清晰觀察到腫瘤侵犯范圍及周邊血管生長情況，裸鼠大體解剖后可觀察到轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和肺臟轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞的GFP表達(dá)。 3.FACS法純化皮下原發(fā)灶及肺部轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞，利用SAGE技術(shù)，皮下原發(fā)灶共獲得長標(biāo)簽5420個，肺部轉(zhuǎn)移灶共獲得長標(biāo)簽5016個。通過比較兩個文庫中標(biāo)簽序列特性及對應(yīng)基因，以差異在4倍以上為標(biāo)準(zhǔn)，在轉(zhuǎn)移灶中獲得了20個下調(diào)基因和33個上調(diào)基因。 結(jié)

7、論: 1.穩(wěn)定表達(dá)GFP的人高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞株95D/GFP-1的建立為實時觀察和示蹤肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)生提供了理想的細(xì)胞株。 2.95D/GFP-1皮下接種BALB/C裸鼠可在肝臟、肺部和淋巴結(jié)形成轉(zhuǎn)移灶，成功構(gòu)建了人肺癌細(xì)胞株自發(fā)轉(zhuǎn)移模型。 3.成功建立了人肺癌細(xì)胞株皮下原發(fā)灶和肺部轉(zhuǎn)移灶兩個SAGE文庫，通過比較獲得了差異表達(dá)基因共53個，腫瘤獲得轉(zhuǎn)移潛能可能與這些基因表達(dá)改變有關(guān)。并擬繼續(xù)深入研究這些基因在