水楊酸對大鼠下丘GABAA受體α1亞單位及大型GABA能神經(jīng)元影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言：
　　 耳鳴是指在沒有外界刺激的情況下耳中出現(xiàn)聲音。大劑量水楊酸可引起人和動(dòng)物一過性的耳鳴。水楊酸引發(fā)耳鳴的起源部位及其發(fā)生機(jī)制尚未明確。目前比較公認(rèn)的機(jī)制是水楊酸引起一系列神經(jīng)活動(dòng)的改變,破壞了腦活動(dòng)的興奮抑制平衡,引起神經(jīng)過度興奮而造成耳鳴。γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種主要的神經(jīng)遞質(zhì)。電生理學(xué)研究證實(shí)在耳鳴相關(guān)的神經(jīng)活動(dòng)中存在γ-氨基丁酸介導(dǎo)的抑制活動(dòng)減弱的現(xiàn)象,然而目前參與這一過程的分子機(jī)制和細(xì)胞特異

2、性通路尚不明確。GABAA型受體(GABAA)是由多種亞單位構(gòu)成的五聚體離子通道蛋白。該受體蛋白的功能主要取決于其亞單位的組成及五聚體的分子構(gòu)象。已發(fā)現(xiàn)有八種不同的GABAA亞單位:α、β、γ、δ、θ、ε、π和ρ。在大鼠下丘最主要的GABAA亞單位是α1。目前已知α1亞單位與癲癇、慢性酒精中毒癥狀、酒精戒斷癥狀、焦慮癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。在聽覺系統(tǒng),則與聲創(chuàng)傷等疾病的發(fā)生有關(guān)。但α1亞單位的確切生理功能乃至是否參與耳鳴的發(fā)生尚不明確。

3、下丘是上行性聽覺傳導(dǎo)通路必經(jīng)的中繼站。以往電生理、分子生物學(xué)等多方面研究結(jié)果均提示下丘是潛在的耳鳴起源部位。此外,多項(xiàng)研究結(jié)果顯示在大鼠的下丘有多種GABA能神經(jīng)元存在,但目前對它們各自的功能和纖維聯(lián)系知之甚少。最近有報(bào)道推測胞膜外覆蓋著囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2(VGLUT2)+谷氨酸能軸體末端的大型GABA能神經(jīng)元可能是頂蓋丘腦輻射的起源。但目前尚未見該神經(jīng)元與水楊酸耳毒性發(fā)生相關(guān)的研究報(bào)道。
　　 目的：
　　 本次研究的

4、目的是通過對GABAA相關(guān)蛋白在水楊酸注射前后的整個(gè)下丘及在大型GABA能神經(jīng)元中的分子生物學(xué)及形態(tài)學(xué)檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)對比分析,揭示大劑量水楊酸是否能夠引發(fā)相關(guān)蛋白的表達(dá)及分布的顯著變化,從而初步探討導(dǎo)致水楊酸耳毒性發(fā)生的可能的分子機(jī)制及細(xì)胞特異性聽覺傳遞通路。
　　 方法：
　　 46只成年雌性SPF級(jí)SD大鼠,14-15周齡,重250-350g,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組。兩組動(dòng)物分別腹腔注射水楊酸和等量生理鹽水,連續(xù)

5、注射5天。各組動(dòng)物于第六天用水合氯醛深度麻醉后,其中30只大鼠(10只實(shí)驗(yàn)組,10只對照組)的下丘于5min之內(nèi)取出并立即于-80℃凍存以備進(jìn)行免疫印跡及實(shí)時(shí)定量PCR檢測。另外16只大鼠經(jīng)心臟灌流固定后取腦以備電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)和免疫組化切片檢測。
　　 1、總RNA提取,反轉(zhuǎn)錄,實(shí)時(shí)定量PCRGABAAα1、GABAAβ2亞單位(GABAAβ2)、GABAAγ2亞單位(GABAAγ2)、谷氨酸脫羧酶65(GAD65)、谷氨酸脫

6、羧酶67(GAD67)在實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠下丘的mRNA表達(dá)水平用real-timeRT-PCR來檢測。
　　 2、免疫組織化學(xué)GABAAα1在實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠下丘細(xì)胞水平的分布用免疫組織化學(xué)來檢測。
　　 3、免疫沉淀和免疫印跡檢測GABAAα1在實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠下丘的蛋白定量用免疫沉淀和免疫印跡方法來檢測。
　　 4、電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)GABAAα1在大鼠下丘亞細(xì)胞水平的分布特點(diǎn)用DAB標(biāo)記的電鏡免疫細(xì)胞學(xué)

7、來檢測。并比較該蛋白在實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠下丘不同部位所占百分比的差異。
　　 5、激光共聚焦顯微鏡免疫組化GABAAα1、GAD67在實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠下丘大型GABA能神經(jīng)元中的分布和蛋白表達(dá)水平以及與大型GABA能神經(jīng)元形成突觸的谷氨酸能軸體末端內(nèi)VGLUT2蛋白表達(dá)用激光共聚焦顯微鏡檢測。切片經(jīng)GAD67,VGLUT2和GABAAαl三種熒光抗體標(biāo)記。
　　 結(jié)果：
　　 1、實(shí)時(shí)定量PCR:實(shí)驗(yàn)組的GAB

8、AAα1,GAD67的mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組,即分別為對照組的0.43倍和0.40倍(P＜0.05,P＜0.01)。GABAAβ2,γ2和GAD65實(shí)驗(yàn)組mRNA水平分別為對照組的0.89倍,1.56倍和0.84倍,P＞0.05。即大劑量水楊酸能夠降低大鼠下丘GABAAα1、GAD67的mRNA表達(dá),而對GABAAβ2、GABAAγ2和GAD65的mRNA表達(dá)沒有明顯影響。
　　 2、免疫組化:可見α1亞單位在大鼠下丘表

9、達(dá)豐富,尤其在中央核區(qū),各組下丘的中央核區(qū)均可見較強(qiáng)的α1亞單位陽性染色。陽性染色主要分布在胞膜和胞質(zhì)。此外,陽性染色在大小不同的多種細(xì)胞中均可見到。僅靠免疫組化染色不能區(qū)分這些細(xì)胞,但是顯然在一類體型遠(yuǎn)大于其它的細(xì)胞中普遍出現(xiàn)很強(qiáng)的α1亞單位陽性染色,它們通常直徑＞10μm,主要分布于中央核區(qū)。
　　 3、免疫沉淀和免疫印跡:水楊酸注射組GABAAα1蛋白水平明顯降低(對照組,0.65±0.08,實(shí)驗(yàn)組0.38±0.1,P＜0

10、.01)。結(jié)果提示水楊酸注射后GABAAα1蛋白在大鼠下丘的表達(dá)水平明顯降低。
　　 4、電鏡免疫細(xì)胞化學(xué):GABAAα1在大鼠下丘亞細(xì)胞水平的分布用電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)來檢測。結(jié)果顯示,GABAAα1陽性染色在實(shí)驗(yàn)組和對照組均呈現(xiàn)為密集的暗黑色DAB沉淀,或濃聚在突觸部位(突觸后膜或相對應(yīng)的突觸前膜)或覆蓋于突觸外胞內(nèi)膜性器官上。大多數(shù)的陽性標(biāo)記出現(xiàn)在對稱性突觸(抑制性)。興奮性突觸多無GABAAα1陽性標(biāo)記。對兩組中GABAA

11、α1在突觸和突觸外分布的比較結(jié)果顯示,對照組中GABAAα1陽性染色在突觸部位占70.1±3.5%,而實(shí)驗(yàn)組突觸部位的陽性染色僅占52.2±2.8%(P＜0.05),即GABAAα1陽性染色在對照組中央核區(qū)域突觸部位所占比率明顯較實(shí)驗(yàn)組高。
　　 5、激光共聚焦顯微鏡:GABAAα1和GAD67蛋白表達(dá):掃描結(jié)果顯示,GABAAα1和GAD67蛋白在LGNs中表達(dá)均很豐富。在LGNs中,GABAAα1和GAD67蛋白均分布在神經(jīng)

12、元胞質(zhì)和胞膜以及突起上。對兩組動(dòng)物下丘LGN中GAD67和GABAAα1熒光強(qiáng)度的半定量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示,對照組GAD67和GABAAα1的平均熒光強(qiáng)度分別為102±8.0和87±6.2,而在實(shí)驗(yàn)組中分別為83±12.2和59±9.5。該結(jié)果提示,在每組所選的30個(gè)LGNs中,GAD67和GABAAα1的平均熒光強(qiáng)度在水楊酸注射后出現(xiàn)明顯下降,P＜0.05。即水楊酸注射后GAD67和GABAAα1在LGNs上的蛋白表達(dá)明顯減少。

13、　　 VGLUT2+谷氨酸能軸體末端:VGLUT2蛋白在激光共聚焦掃描中呈現(xiàn)出點(diǎn)狀標(biāo)記的模式。掃描結(jié)果顯示VGLUT2+軸體末端位于LGNs的胞體和樹突的表面。用ImageJ圖像分析軟件對掃描圖像進(jìn)行三維重建后顯示,VGLUT2+軸體末端在LGNs胞膜表面呈現(xiàn)不均勻分布。對每個(gè)選定的LGNs中VGLUT2平均熒光強(qiáng)度測量結(jié)果顯示,對照組中VGLUT2的平均熒光強(qiáng)度是123±11.5而在實(shí)驗(yàn)組中是120±9.6。統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示水楊酸注射沒

14、有使軸體末端中的VGLUT2蛋白表達(dá)發(fā)生明顯的變化,P＞0.05。
　　 討論：
　　 1、GABAAα1和GAD67轉(zhuǎn)錄具有活動(dòng)依賴性
　　 很多研究證實(shí)α1亞單位的mRNA表達(dá)是活動(dòng)依賴性的,并且發(fā)現(xiàn)了一些可能存在的受復(fù)雜系統(tǒng)調(diào)控的機(jī)制。N-甲基-D-天冬氨酸,GABA和苯二氮卓都能在一定條件下改變?chǔ)?亞單位的mRNA水平。有兩種谷氨酸脫羧酶(GADs)催化GABA的合成:GAD67和GAD65(分別由Gad

15、1和Gad2基因編碼),它們的基因調(diào)控過程迥異。GAD67活動(dòng)的生理調(diào)節(jié)的關(guān)鍵步驟就是Gad1的轉(zhuǎn)錄,該過程在發(fā)育過程中受到神經(jīng)活動(dòng)和發(fā)育經(jīng)歷的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。因此,在本實(shí)驗(yàn)中,α1亞單位和GAD67在實(shí)驗(yàn)組下丘中的mRNA表達(dá)改變可能就是通過這些途徑來實(shí)現(xiàn)的。
　　 2、GABAAα1基因和蛋白表達(dá)減少及亞細(xì)胞水平分布的改變可能影響GABAA的功能
　　 GABAA是含有氯離子通道的五聚體膜蛋白。目前已知α1亞單位參與形成G

16、ABAA中苯二氮卓結(jié)合位點(diǎn)及神經(jīng)類固醇分子結(jié)合位點(diǎn),并有可能介導(dǎo)苯二氮卓引起的共濟(jì)失調(diào)、鎮(zhèn)靜和慢性酒精中毒綜合征。電生理研究證實(shí),α1亞單位能產(chǎn)生快速電流衰減并引起對唑吡坦的敏感性。因?yàn)棣?是大鼠下丘GABAA中含量最豐富的亞單位,水楊酸注射后其基因和蛋白含量降低可能由于苯二氮卓及神經(jīng)類固醇受體結(jié)合位點(diǎn)形成缺陷及快速電流衰減障礙而影響GABAA的功能。此外,在細(xì)胞的不同部位存在兩種GABAA,即突觸GABAA和突觸外GABAA。亞單位組

17、成的不同造成兩者的藥理學(xué)特性迥異。本實(shí)驗(yàn)中電鏡免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示GABAAα1參與形成突觸和突觸外兩種GABAA的形成。以往耳聾相關(guān)研究結(jié)果顯示GABAA能夠在突觸和胞質(zhì)之間移動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)中就GABAAα1陽性染色在突觸和突觸外分布的分析結(jié)果提示部分GABAAα1可能在水楊酸注射后由突觸上遷移到了突觸外。而GABAA由突觸部位離開是失去在突觸部位原有功能的可靠信號(hào)。
　　 3、GABAAα1和GAD67表達(dá)水平可能影響LGNs的

18、功能
　　 結(jié)果5顯示,GABAAα1和GAD67在LGNs上表達(dá)均很豐富。由于α1亞單位在GABAA中具有重要功能,因此LGNs中α1亞單位的顯著減少很可能由此而影響LGNs的功能。谷氨酸合成GABA的過程由GAD67催化,超過90%的基礎(chǔ)GABA是由GAD67催化合成的。GABA的合成是GABA代謝中的限速步驟,很容易影響細(xì)胞及囊泡中的GABA含量。有研究顯示,敲除GABA能中間神經(jīng)元的GAD67可引起大腦皮質(zhì)器官型培養(yǎng)的細(xì)

19、胞在突觸形成,軸突衍生和神經(jīng)支配區(qū)域方面出現(xiàn)自發(fā)的嚴(yán)重缺陷。近來有研究顯示LGNs可能是向內(nèi)側(cè)膝狀體(MGB)投射的抑制性頂蓋丘腦輻射的起源。然而,GABA能和谷氨酸能神經(jīng)元均參與形成MGB投射。因此,LGNs中GAD67和GABAAα1表達(dá)減少可能會(huì)影響LGNs介導(dǎo)的下丘與MGB之間的抑制性投射,導(dǎo)致兩者間原有的興奮和抑制平衡被破壞。
　　 4、VGLUT2+軸體末端對水楊酸的反應(yīng)相對穩(wěn)定VGLUT2蛋白的功能是囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)

20、體,負(fù)責(zé)將谷氨酸轉(zhuǎn)移到突觸小泡中。在本實(shí)驗(yàn)中,標(biāo)記VGLUT2的熒光強(qiáng)度代表參與形成軸體突觸的谷氨酸在突觸末端的含量。多個(gè)研究已證實(shí)大鼠下丘的LGNs通過軸體末端接受VGLUT2+谷氨酸能沖動(dòng)傳入,但這些末端的起源和功能并未弄清。有人提出有可能使LGNs發(fā)出的神經(jīng)沖動(dòng)更加迅速。本實(shí)驗(yàn)中,水楊酸注射后VGLUT2蛋白在軸體末端的表達(dá)沒有明顯變化。這或許提示了該軸體突觸與水楊酸造成的神經(jīng)過度興奮并無密切聯(lián)系。
　　 結(jié)論：