尸體肝組織推斷死亡時(shí)間的生物化學(xué)和生物力學(xué)的研究.pdf

1、目的和意義：
　　推斷死亡時(shí)間(Postmortem Interval,PMI)是法醫(yī)鑒定首要任務(wù)之一。迄今仍沒(méi)有公認(rèn)準(zhǔn)確的實(shí)際方法，有效推斷PMI方法研究已成為法醫(yī)學(xué)的歷史性難題和挑戰(zhàn)。肝臟為腹腔內(nèi)體積質(zhì)量均最大的相對(duì)獨(dú)立的特別是組織結(jié)構(gòu)較均一的實(shí)質(zhì)性?xún)?nèi)臟器官，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、碳水化合物和核酸生物大分子。肝組織死后變化不僅表現(xiàn)在形態(tài)學(xué)方面，更是基于自身生化物質(zhì)的改變，為各類(lèi)方法檢測(cè)提供了廣泛的選擇性。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技

2、術(shù)（Gas chromatography-Mass spectrometry，GC-MS)利用色譜分離和質(zhì)譜鑒定,具有極高分辨率和靈敏度，可通過(guò)參考和比較的標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫(kù)，進(jìn)行相關(guān)物質(zhì)的代謝組學(xué)溯源，可對(duì)小分子有機(jī)物進(jìn)行快速的定性和準(zhǔn)確的定量分析，篩選到對(duì)推斷PMI具有重要價(jià)值的小分子代謝物?；诒菊n題組前期的肝組織形態(tài)學(xué)和生物力學(xué)推斷PMI研究中，發(fā)現(xiàn)尸體組織的自溶腐敗過(guò)程，本質(zhì)上屬于蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和碳水化合物、核酸生物大分子物質(zhì)單向性降解

3、或水解，產(chǎn)生氨基酸、堿基、脂肪酸等結(jié)構(gòu)性小分子物質(zhì)的過(guò)程，本研究利用GC-MS法，通過(guò)內(nèi)標(biāo)相對(duì)定量檢測(cè)不同溫度條件下，肝組織氨基酸類(lèi)等物質(zhì)死后的時(shí)序性變化規(guī)律及其與推斷PMI相關(guān)方程。同時(shí)，綜合前期的生物力學(xué)、量化病理組織學(xué)等相關(guān)PMI指標(biāo)，探討利用綜合性推斷PMI的可行性和最佳方案。
　　材料與方法：
　　屠宰場(chǎng)放血處死的健康成年家豬全肝組織，置于15℃、25℃、30℃恒溫及75％恒濕的人工智能氣候箱中，在0h-120h間

4、每隔12h為一時(shí)間點(diǎn)取材，8個(gè)樣本/時(shí)間點(diǎn)。
　　1、GC-MS檢測(cè)：各時(shí)間點(diǎn)取材剔掉肝被膜、避開(kāi)血管，取0.1g肝實(shí)質(zhì)組織，80%乙醇溶液1:10固定72h，500μL的0.1mol/L酸化、勻漿、離心，取上清液400μL，乙腈去蛋白后上清50μL，20μL內(nèi)標(biāo)正亮氨酸，混勻吹干；50μL的MTBSFA和50μL吡啶、微波中火衍生化2分鐘；靜置1h，1μL進(jìn)樣，安捷倫氣相色譜質(zhì)譜儀自帶GC/MS數(shù)據(jù)分析工作站進(jìn)行定量分析，標(biāo)記各

5、氨基酸，計(jì)算峰面積，以各氨基酸峰面積除以?xún)?nèi)標(biāo)峰面積計(jì)算各氨基酸相對(duì)含量。
　　2、形態(tài)學(xué)及生物力學(xué)：均取25℃恒溫75%恒濕條件下，各時(shí)間點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化拍照裝置拍照并觀察肝組織大體形態(tài)變化，“六定”規(guī)范化取材，選肝右側(cè)葉較厚區(qū)域，剔除被膜后，沿長(zhǎng)軸切取組織大小約2.5×2.0×2.0cm3檢材，2個(gè)×8組檢材，分別4%甲醛和80%酒精按體積比（組織與固定液)1:10比例固定72h后，修整成1.5×1.0×1.0cm3長(zhǎng)方體標(biāo)準(zhǔn)樣件，便攜

6、式生物力學(xué)檢測(cè)儀(KDI-0.2)縱軸單向壓縮，記錄生物力學(xué)參數(shù)。同時(shí)，另肝組織4%甲醛常規(guī)固定，制作石蠟肝組織切片，分別HE、Masson特殊染色，Image-Pro Plus6.0量化分析，計(jì)算空隙總面積、膠原纖維總面積及總IOD。大體照片利用Photoshop CS5軟件計(jì)算三原色（RGB）值。
　　統(tǒng)計(jì)分析：
　　采用Simca-P13.0進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，包括主成分分析（Principal Component An

7、alysis，PCA)、偏最小二乘法（Partial Least Square，PLS)，觀察整體變化趨勢(shì)及代謝輪廓。采用SPSS進(jìn)行單因素方差分析Bonferroni法兩兩比較均值、簡(jiǎn)單線性回歸（Linear Regression，LR)、逐步多元線性回歸（Stepwise Multiple Linear Regression,SMLR)，P＜0.05為顯著性差異，推導(dǎo)多種代謝物和多指標(biāo)推測(cè)PMI線性擬合公式。用GraphPad Pr

8、ism5統(tǒng)計(jì)圖標(biāo)軟件制圖。
　　結(jié)果：
　　1、固定前肝組織R、G、B值均呈時(shí)序性下降，分別R、G、B均值(Y)與PMI（X)簡(jiǎn)單線性回歸分析，R色值的相關(guān)性最好，各組間比較P＜0.05：YR=-0.572X+131.722（R2=0.741)。
　　2、肝組織形態(tài)學(xué)分析，間隙總面積呈時(shí)序性增加趨勢(shì)，染色膠原纖維總面積及總IOD時(shí)序性下降，組織間隙總面積與PMI相關(guān)性較好，各組間比較P＜0.05：Y間隙總面積=1223

9、3.81X+23794.57，R2=0.745。
　　3、4%甲醛和80%乙醇固定肝組織的各生物力學(xué)參數(shù)均隨PMI呈下降趨勢(shì)，甲醛固定組的PMI相關(guān)性?xún)?yōu)于乙醇，其中最大力與PMI相關(guān)性最好指標(biāo)。甲醛固定組Y最大力=-0.901X+109.06（R2=0.915)，乙醇固定Y最大力=-0.685X+70.77（R2=0.814)。
　　4、80%乙醇固定豬肝組織GC-MS檢測(cè)，各溫度組氨基酸含量隨PMI呈整體增加趨勢(shì)：

10、　　⑴25℃組氨基酸含量與PMI的PCA：模型R2X=0.834，Q2=0.69，所測(cè)的全部氨基酸在72h內(nèi)區(qū)分較好，與PMI呈明顯線性增高趨勢(shì)的“窗口期”為24-84h，0-24h呈前“平臺(tái)期”，84h后呈“波動(dòng)性”，提示25℃環(huán)境溫度下肝組織最佳推斷PMI為死后72h之內(nèi)。PLS分析：R2X=0.815，R2Y=0.815，Q2=0.911，其中VIP＞1的成分，即對(duì)模型貢獻(xiàn)大的成分與0-120h內(nèi)線性較好的氨基酸基本一致，回歸方程

11、分別為：Y丙氨酸=0.026x-0.034（R2=0.873)，Y亮氨酸=0.035X-0.335（R2=0.886)，Y纈氨酸=0.019X-0.177(R2=0.86)，Y異亮氨酸=0.016X-0.148（R2=0.808)；Y苯丙氨酸=0.007X-0.081（R2=0.710)；Y甘氨酸=0.011X+0.204（R2=0.688)；Y甲硫氨酸=0.002X-0.014（R2=0.681)。各氨基酸綜合多元線逐步回歸方程：YP

12、MI=11.456X亮氨酸+13.605X丙氨酸+14.162X甘氨酸+6.110（R2=0.922，P＜0.001，模型F=604.266，SE=10.629)。
　?、?0℃組氨基酸含量與PMI的PCA：R2X=0.981，Q2=0.857，各氨基酸在60h較集中，可以較好的分離，與PMI呈明顯線性增高趨勢(shì)的“窗口期”為12-72h，0-12h呈前“平臺(tái)期”，84h后呈“波動(dòng)性”，提示30℃環(huán)境溫度下肝組織最佳推斷PMI為死后

13、72h之內(nèi)。PLS分析:R2X=0.815，R2Y=0.815，Q2=0.911，其中VIP＞1的成分，即對(duì)模型貢獻(xiàn)大的成分，與0-120h內(nèi)線性較好的氨基酸基本一致，回歸方程分別為Y丙氨酸=0.037X+(R2=0.895)；Y纈氨酸=0.029X-0.12(R2=0.893)；Y亮氨酸=0.046X+0.242（R2=0.812)；Y異亮氨酸=0.022X-0.018（R2=0.887)；Y甘氨酸=0.016X+0.221（R2=0

14、.787)；Y苯丙氨酸=0.005X+0.024(R2=0.701)。各氨基酸綜合多元線性逐步回歸分析方程: YPMI=13.632X丙氨酸+19.051X異亮氨酸+4.471（R2=0.920，P＜0.001，模型F=310.985，SE=10.629)。
　?、?5℃組0-168h內(nèi)，各氨基酸隨PMI變化不明顯。綜合3個(gè)溫度組所有時(shí)間點(diǎn)氨基酸含量的PCA，3個(gè)主成分模型：R2X=0.847，Q2=0.703，三個(gè)溫度組0-24

15、h存在交叉，24h后各溫度組散點(diǎn)分布較集中，且相互分離，說(shuō)明不同溫度組的氨基酸相對(duì)含量存在顯著性差異，綜合比較溫度升高，同一時(shí)間點(diǎn)的氨基酸相對(duì)含量也高，氨基酸生成速率25℃時(shí)約為15℃的3-5倍左右，30℃約為25℃的1.2-1.5倍左右。
　　5、綜合25℃/濕度75%組0-120h肝組織GC-MS檢測(cè)的氨基酸相對(duì)含量值、生物力學(xué)參數(shù)指標(biāo)、形態(tài)學(xué)量化指標(biāo)，與PMI多元逐步線性回歸分析得最優(yōu)模型的回歸方程：YPMI=8.848X亮

16、氨酸-0.331X最大力-0.509X平均力-0.24X彈性模量+8.396×10-6 X間隙總面積(R2=0.975；P＜0.001，模型F=318.559，SE=5.282)。
　　結(jié)論：
　　1、GC-MS檢測(cè)80%酒精固定的肝組織，氨基酸相對(duì)含量時(shí)序性變化，可做為一項(xiàng)死后72h內(nèi)推斷PMI新的思路，預(yù)測(cè)誤差10h左右，具有較好的應(yīng)用前景。
　　2、溫度作為影響推斷PMI的重要因素，環(huán)境溫度明顯加快肝組織0-12

17、0h內(nèi)生成氨基酸的速率，30℃約為25℃的1.2-1.5倍，25℃時(shí)約為15℃的3-5倍左右。
　　3、尸體肝組織的自溶腐敗過(guò)程，構(gòu)成組織生物力學(xué)性狀變化的生物化學(xué)物質(zhì)變化的基礎(chǔ)，即物質(zhì)代謝-組織結(jié)構(gòu)-力學(xué)指標(biāo)之間具有內(nèi)在本構(gòu)關(guān)系和構(gòu)效關(guān)系的關(guān)聯(lián)規(guī)律，多方法聯(lián)合檢測(cè)，預(yù)測(cè)誤差在5h左右，可明顯提高PMI的科學(xué)性和準(zhǔn)確性。
　　4、常規(guī)甲醛固定的肝組織更適合生物力學(xué)性狀參數(shù)研究，乙醇固定液的肝組織更適合作為尸體化學(xué)/生物化學(xué)研