一個新的白細(xì)胞膜抗原ZCH-2B8a編碼基因及其生物學(xué)特性的研究.pdf

1、血液系統(tǒng)惡性腫瘤是當(dāng)今醫(yī)學(xué)上的頑癥之一，細(xì)胞膜表面分化抗原(CD)分子的研究能提高對其生物學(xué)行為的認(rèn)識，有利于診斷治療。通過單克隆抗體(單抗)進(jìn)而研究細(xì)胞膜抗原生物學(xué)特性是蛋白質(zhì)功能研究的重要方法。ZCH(ZhejiangChildren'sHospital)-2B8a(簡稱ZCH-2B8a)是本科研究室自行研制的鼠抗人造血細(xì)胞分化抗原的單抗，已經(jīng)提交第8屆國際人類白細(xì)胞分化抗原協(xié)作組會議(HLDA8)鑒定，根據(jù)HLDA8總部經(jīng)大量研究

2、的反饋信息表明：該抗體識別的抗原性質(zhì)不明，屬國際上尚未認(rèn)識的血細(xì)胞膜新的分化抗原(新的CD分子)。因此，對其識別抗原編碼基因克隆與測序及其生物學(xué)功能研究有著重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用前景。 1直標(biāo)鼠抗人新單抗ZCH-2B8a-FITC的研制及鑒定為了深入研究ZCH-2B8a抗體識別抗原的表達(dá)譜及生物學(xué)功能，有利于利用流式細(xì)胞儀作多色分析和抗原阻滯試驗，減少實驗誤差，擬將該抗體研制成異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisoth

3、iocyanate,FITC)直接標(biāo)記的抗體2B8a-FITC。在清潔級BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注射1×106能分泌2B8a單抗(2B8aAb)的雜交瘤細(xì)胞，制備大量2B8aAb腹水。通過Econo-Pac蛋白A柱進(jìn)行親和層析，純化2B8aAb，純化后的2B8aAb經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測，純度高，達(dá)99％以上。采用改良Marsshall法，用FITC標(biāo)記純化的2B8aAb，多余FITC經(jīng)PBS充分透析除去，用紫外分光光度計測定A4

4、95/A280比值為0.56，介于FITC熒光抗體的理想比值0.3～1.0之間。流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示，直標(biāo)單抗2B8a-FITC與間接標(biāo)記法2B8a+GAM-FITC在Raji細(xì)胞上的反應(yīng)峰型相似，雖然前者的平均熒光強(qiáng)度指數(shù)(MFI，98.61)略低于后者(106.89)，但陽性反應(yīng)率基本一致，分別為99.11％和99.00％，表明直標(biāo)熒光抗體2B8a-FITC制備成功。 2ZCH-2B8a單抗及其識別抗原的生物學(xué)特性為了闡明2B

5、8aAb及其抗原的功能和臨床應(yīng)用前景，對抗原和抗體的有關(guān)生物學(xué)特性進(jìn)行了初步探討。 (1)2B8aAb與正常和惡性腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性：采用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測2B8aAb與正常及惡性腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)性，分析2B8aAb的反應(yīng)譜，以陽性細(xì)胞數(shù)≥20％為陽性。 (2)2B8aAg對胰酶消化的抵抗能力：2B8aAg在胰酶消化過的Raji細(xì)胞表面表達(dá)明顯降低，由未消化細(xì)胞上83.57％的高表達(dá)降至26.99％，提示2B8a

6、Ab識別的抗原性質(zhì)可能是蛋白結(jié)構(gòu)，而非糖基之類的分子。 (3)2B8aAb對Nalm-6細(xì)胞生長的影響：應(yīng)用足以封閉Nalm-6細(xì)胞表面抗原的2B8a雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清(含2B8aAb)與之反應(yīng)后繼續(xù)培養(yǎng)，并于24h、48h、72h和96h小時計數(shù)細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示：24h、48h、72h和96h細(xì)胞數(shù)量與對照組比較，無顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.132、0.714、0.265和0.763)，說明2B8aAb對Nalm-6細(xì)胞

7、生長無影響。 (4)2B8aAb與耐藥和非耐藥白血病細(xì)胞株之間的反應(yīng)性比較：2B8aAb與HL60及其耐長春新堿(VCR)耐藥細(xì)胞株HL60/VCR均反應(yīng)，陽性細(xì)胞數(shù)分別為29.64％和47.70％，非參數(shù)檢驗比較，P=0.343＞0.05，沒有統(tǒng)計學(xué)意義；2B8aAg在K562母株上中度表達(dá)(43.06％)，而在其耐藥株K562/HHT(高三尖杉酯堿)低表達(dá)(17.76％)，耐藥株K562/ADR(阿霉素)和K562/VCR少

8、量表達(dá)(3.53％和4.44％)，通非參數(shù)檢驗分別比較K562與K562/HHT、K562/ADR和K562/VCR的中位陽性細(xì)胞數(shù)，P值分別為0.114＞0.05、0.029＜0.05和0.029＜0.05，2B8aAg在K562耐藥株上的低表達(dá)規(guī)律提示2B8aAg可能與耐藥程度有關(guān)，其機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。 3ZCH-2B8a抗原編碼基因的克隆和測序 鑒于2B8a抗原抗體系統(tǒng)為國際首創(chuàng)，相關(guān)的生物學(xué)特性和功能均未闡明，

9、對2B8aAb識別抗原的編碼基因進(jìn)行克隆分析是闡明該抗原抗體系統(tǒng)生物學(xué)特性的關(guān)鍵方面。經(jīng)胰酶消化后觀察抗原抗體反應(yīng)性的研究結(jié)果表明：2B8aAg為蛋白質(zhì)抗原，所以本研究采用T7噬菌體展示系統(tǒng)，觀察2B8aAb識別抗原的能力，克隆2B8aAg的編碼基因并測定其核苷酸序列。由于2B8aAb與Raji細(xì)胞膜抗原有明顯的反應(yīng)性，Raji細(xì)胞cDNA中必定存在編碼2B8aAb識別抗原的基因序列，于是我們首先建立T7噬菌體展示的Raji細(xì)胞cDNA

10、表達(dá)文庫。。初始文庫滴度太低，將文庫擴(kuò)增后利用和保存，擴(kuò)增后滴度為2.5×1010pfu/ml。文庫構(gòu)建成功，利用2B8aAb淘洗文庫，經(jīng)過五輪淘洗使2B8aAg陽性噬菌體富集達(dá)最大量，然后通過噬斑挑取及PCR技術(shù)，成功獲得了6個陽性克隆。6個陽性噬斑的cDNA插入片段序列測定后經(jīng)美國基因庫核酸序列查找(BLASTn)程序進(jìn)行同源性搜索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中5個插入片斷基因序列與美國NCBI基因庫中一個假定基因(BC094882)是同源序列；再

11、通過DNASIS軟件將5個插入片段的基因序列轉(zhuǎn)換成的蛋白序列后與BC094882基因編碼的蛋白序列比較，發(fā)現(xiàn)正好與BC094882蛋白羧基末端的228個氨基酸序列完全吻合，但與其羧基末端第229位～236位已測出的8個氨基酸序列完全不同。此基因在淋巴結(jié)生發(fā)中心B細(xì)胞中表達(dá)，基因全長2436bp，開放閱讀框為61～2280bp，編碼739個氨基酸。由此推測，2B8aAb所識別的抗原蛋白基因可能是假定基因BC094882，但仍然需要進(jìn)一步研