p38MAPK與整合素β3在乳腺癌中表達(dá)的相關(guān)性研究.pdf

1、目的： 癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及到多方面的因素作用，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracelullar matrix，ECM)的黏附是惡性腫瘤侵襲的首要步驟。腫瘤細(xì)胞與ECM的黏附是通過細(xì)胞表面的特異受體介導(dǎo)的，其中最重要的黏附分子為整合素家族。近來研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞表面的整合素受體與ECM黏附所致的腫瘤細(xì)胞游離出或通過基底膜的過程，是惡性腫瘤浸潤生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的始動(dòng)步驟。生腱蛋白(Tenascin-c,TN-c)是EC

2、M中一種具有獨(dú)特六臂體結(jié)構(gòu)的寡聚糖蛋白，也是整合素的重要配體之一。p38MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase，MAPK)家族的重要成員，最近，p38MAPK信號(hào)通路因以正性調(diào)節(jié)的方式參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程而倍受關(guān)注。為此，本研究檢測了p-p38，整合素β3及其配體在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步在體外研究p38MAPK通路與整合素β3的關(guān)系，為乳腺癌治療提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

3、 材料與方法： 1、材料 80例乳腺癌組織蠟塊取自中國醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院病理科，為2001年～2005年手術(shù)切除標(biāo)本。依據(jù)WHO2003年所推薦的乳腺癌組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類，80例均為浸潤性導(dǎo)管癌。人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231及MCF-7購自協(xié)和醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞庫。 2、主要試劑 鼠抗人p-p38單克隆抗體和兔抗人整合素β3多克隆抗體購自Cell signaling公司，鼠抗人TN-c單克隆抗體購

4、自Sigma公司，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(S-P)超敏免疫組化試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒均購自福州邁新公司。DMEM及RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司。 3、方法免疫組織化學(xué)步驟采用SP法。以PBS 代替一抗設(shè)立空白對(duì)照，以已知乳腺癌陽性片作為陽性對(duì)照。結(jié)果判定：每張切片在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野。整合素β3和p-p38的每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞占全部腫瘤細(xì)胞的百分比分為：陽性細(xì)胞數(shù)<50％為

5、陰性(-)；陽性細(xì)胞數(shù)>50％為陽性(+)。TN-c在細(xì)胞外基質(zhì)中的陽性表達(dá)為基質(zhì)呈斷線狀、連續(xù)線狀或網(wǎng)狀棕黃色著色。著色強(qiáng)度分為無色或淺黃色為陰性(-)，黃色或棕黃色為陽性(+)。 Western印跡法：RIPA buffer裂解液，超聲處理，高速低溫離心提取總蛋白，用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測定。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印，封閉后加相應(yīng)一抗、二抗及DAB顯色，觀察拍照，進(jìn)行灰度值測定。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

6、行x<'2>檢驗(yàn)和Pearson相關(guān)分析。確定P<0.05為差異有顯著性。 結(jié)果： 1、p-p38、整合素β3、TN-c在乳腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析免疫組化結(jié)果顯示，p-p38蛋白主要位于乳腺癌細(xì)胞核內(nèi)，呈棕黃色顆粒，陽性率為57.50％(46/80)。整合素β3蛋白主要位于乳腺癌細(xì)胞漿內(nèi)，呈棕黃色顆粒，陽性率為56.25％(45/80)，而在正常乳腺中不表達(dá)；TN-c蛋白主要分布于細(xì)胞外基質(zhì)中，呈斷線狀、連續(xù)線狀或

7、網(wǎng)狀著色，陽性率為86.25％(69/80)，在正常乳腺中，表達(dá)于基底膜。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，每兩者之間表達(dá)分別存在正相關(guān)(r=0.584，P<0.05；r=0.237，P<0.05；r=0.293，P<0.05)。 2、乳腺癌組織中p-p38、整合素β3、TN-c表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系p-p38、整合素β3及TN-c表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)(P<0.05)，而與患者的年齡、腫瘤大小無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

8、 3、兩種轉(zhuǎn)移性不同的乳腺癌細(xì)胞中p-p38、整合素β3、TN-c的表達(dá)Western印跡法檢測結(jié)果顯示，高轉(zhuǎn)移性的MDA-MB-231細(xì)胞中p-p38及整合素β3、TN-c表達(dá)水平高于低轉(zhuǎn)移性的MCF-7細(xì)胞。MCF-7細(xì)胞中TN-c不表達(dá)。 4、用anti-整合素β3和anti-TN-c抗體分別阻斷MDA-MB-231細(xì)胞后p-p38蛋白表達(dá)的變化用20μg/ml的抑制性anti-整合素β3抗體及抑制性anti-TN-c抗

9、體分別處理MDA-MB-231細(xì)胞24h后，用Western blot檢測MDA-MB-231細(xì)胞中p-p38的表達(dá)量。結(jié)果顯示，兩種方法處理后的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的p-p38蛋白表達(dá)水平均下降。 結(jié)論： 1、整合素β3、TN-c、p-p38表達(dá)與乳腺癌臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。 2、整合素β3、TN-c和p-p38在乳腺癌中表達(dá)存在正相關(guān)。 3、阻斷整合素β3、TN-c后，乳腺癌細(xì)胞中p-p