慢病毒載體表達人B型利鈉肽的方法學探討.pdf

1、目的：探索構(gòu)建能表達人B型利鈉肽(hBNP)的pLenti6/V5-hBNP載體的方法，以實現(xiàn)hBNP基因在骨骼肌成肌細胞中長久、穩(wěn)定的表達。方法：體外培養(yǎng)SD(SpragueDawley)鼠骨骼肌成肌細胞，并通過免疫組織化學方法鑒定所得細胞、用臺酚蘭染色確定培養(yǎng)細胞的活性并繪制生長曲線。將目的基因hBNP亞克隆到真核細胞表達載體pLenti6/V5-D-TOPO載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLenti6/V5-hBNP。將pLenti6/V5

2、-hBNP及陽性對照質(zhì)粒pLenti6/V5-EGFP分別用lipofectamin2000介導轉(zhuǎn)染293FT細胞，獲得病毒顆粒；用病毒顆粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的SD乳鼠骨骼肌成肌細胞。熒光顯微鏡下計數(shù)確定陽性對照質(zhì)粒的瞬時轉(zhuǎn)染數(shù)，從而估計該基因的瞬時轉(zhuǎn)染效率。加入篩選試劑以獲得穩(wěn)定表達異源B型利鈉肽(BNP)的成肌細胞。收集瞬時轉(zhuǎn)染及篩選后的細胞培養(yǎng)基，用酶連結(jié)免疫吸附分析(ELISA)檢測試劑盒檢測hBNP的表達水平。結(jié)果：聚合酶鏈式反應(yīng)法

3、、雙酶切法及DNA測序顯示hBNP基因成功地插入到pLenti6/V5-D-TOPO載體中；免疫組化顯示此法培養(yǎng)成肌細胞質(zhì)的純度達到94％，并且臺酚蘭染色細胞的存活率亦達到了94％以上；陽性對照質(zhì)粒的病毒顆粒感染細胞12h后，在熒光顯微鏡下觀察，其轉(zhuǎn)染效率達60％以上。檢測收集的上清，結(jié)果與陰性對照有顯著差別(P＜0.01)，觀察至第4w，hBNP仍持續(xù)穩(wěn)定表達。結(jié)論：本實驗成功構(gòu)建了能在真核細胞內(nèi)表達人B型鈉尿肽的重組質(zhì)粒pLenti