氧化損傷體內(nèi)外衰老模型的建立與應(yīng)用及格爾德霉素在Beagle犬藥代動力學(xué)的研究.pdf

1、衰老機(jī)制的研究是生命科學(xué)的研究熱點。衰老機(jī)制的研究離不開衰老模式系統(tǒng)的建立和應(yīng)用。衰老模式系統(tǒng)一般包括酵母、線蟲、果蠅、鼠等模式生物和細(xì)胞模型。細(xì)胞模型是目前國際上公認(rèn)的重要研究模型之一。細(xì)胞是生物體的基本單位，細(xì)胞衰老與整體動物衰老有著密切的關(guān)系。 衰老的自由基學(xué)說認(rèn)為，自由基和活性氧隨齡累積，損傷蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子并引起結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞衰老或生物體整體衰老。深入研究衰老的機(jī)制，建立適宜的衰老模型，對于尋找

2、和開發(fā)延緩衰老的藥物具有十分重要的意義。 細(xì)胞受到氧化劑刺激、原癌基因?qū)氲葧a(chǎn)生細(xì)胞衰老的特征，又稱作早熟性衰老，其特征與機(jī)制和細(xì)胞衰老基本一致。本研究分別用H2O2和D-半乳糖建立了細(xì)胞衰老的體外模型，并對其衰老機(jī)制進(jìn)行了探討。同時進(jìn)行了D-半乳糖致整體動物衰老的實驗研究。 格爾德霉素(Geldanamycin)是從鏈霉菌培養(yǎng)液中分離得到的苯醌安莎類抗生素，具有廣泛的抗腫瘤和抗病毒活性。本論文研究了其在Beale犬體

3、內(nèi)的藥代動力學(xué)過程。 1.H2O2誘導(dǎo)2BS細(xì)胞衰老模型的藥物篩選 100μM的H2O2與2BS細(xì)胞孵育20h，MTT法檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率大約下降20％左右。提前2h給予不同濃度的中藥單體組分如金銀花提取物、板栗提取物以及葛根素、白藜蘆醇、常見的抗氧化劑NAC等，2BS細(xì)胞的存活率會產(chǎn)生較大變化，而且此變化與給藥濃度有關(guān)。金銀花的提取物JH-34、RB-44、RB-55可使存活率提高20％以上，分別為20.3％、23.0

4、％、21.2％。白藜蘆醇、葛根素、NAC也能夠使2BS細(xì)胞的存活率提高20％以上， 1亞致死量的H2O2處理年輕的成纖維細(xì)胞可以產(chǎn)生早老型特征，該模型建立方法簡單，檢測指標(biāo)可靠，是篩選延緩衰老藥物的良好模型。篩選得到的金銀花提取物等具有潛在的開發(fā)應(yīng)用價值。 2.2D-半乳糖致細(xì)胞早熟性衰老的機(jī)制 用特異的ROS熒光探針H2DCFDA，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了D-半乳糖作用后細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化，結(jié)果顯示，年輕的2B

5、S細(xì)胞或MEF細(xì)胞，經(jīng)D-半乳糖或H2O2作用后，胞內(nèi)的ROS水平明顯升高。當(dāng)用自由基清除劑NAC共同孵育細(xì)胞后，其ROS水平則降低。這表明，D-半乳糖作用于細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的自由基含量升高，這可能是細(xì)胞產(chǎn)生早老的誘因。 為了進(jìn)一步檢測ROS對細(xì)胞內(nèi)蛋白的影響，我們用試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)SOD活性和MDA含量。結(jié)果提示，細(xì)胞經(jīng)D-半乳糖作用后細(xì)胞內(nèi)MDA含量明顯上升，而SOD2活性下降。這提示，這可能是細(xì)胞內(nèi)升高的ROS攻擊生物膜中的

6、多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并因此形成脂質(zhì)過氧化物增多所致，而細(xì)胞內(nèi)SOD活性的下降可能使損傷進(jìn)一步加劇。 WesternBlot結(jié)果表明，2BS細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的D-半乳糖處理72h后，P53、P21、P16被上調(diào)，CHK2蛋白也被上調(diào)，而PCNA表達(dá)降低，Rb的磷酸化程度明顯降低。 上述結(jié)果表明，D-半乳糖誘導(dǎo)細(xì)胞衰老的可能機(jī)制為：由于D-半乳糖的作用細(xì)胞內(nèi)ROS增加，損傷了DNA和細(xì)胞內(nèi)蛋白，進(jìn)而使Chk2

7、被激活，激活的Chk2又使P53蛋白表達(dá)增加，進(jìn)而啟動P21和P16的功能，使Rb磷酸化程度降低，與E2F因子結(jié)合，至此細(xì)胞衰老的信號通路被激活，從而引發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生早老。SIRT1蛋白的含量升高，其原因有待進(jìn)一步探討。 3.D-半乳糖致小鼠衰老模型的實驗研究 D-半乳糖連續(xù)皮下注射C57BL/6J小鼠8周，同時腹腔注射葛根素，采用跳臺法和水迷宮法檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)現(xiàn)D-半乳糖模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力較差；免疫組化結(jié)果表

8、明，D-半乳糖模型小鼠大腦皮層和海馬中GFAP、NT-3含量增加；體內(nèi)SOD水平下降、MDA含量升高，而且肝、腦、腎、肌肉組織中P21蛋白表達(dá)增高等現(xiàn)象，這可能是細(xì)胞衰老在整體動物水平的體現(xiàn)。黃酮類化合物葛根素可以部分拮抗這種改變。 4.格爾德霉素在Beagle犬藥代動力學(xué)的研究 建立了測定Beagle犬血漿內(nèi)格爾德霉素的固相萃取-HPLC測定方法，方法學(xué)確證實驗表明，格爾德霉素的線性范圍為0.01～1.0μg·mL-1

9、，r=0.9991。日內(nèi)和日間精密度分別為均小于10％；回收率在85％～105％之間。 Beagle犬單次靜脈注射格爾德霉素，劑量分別為0.25，0.5，1.0mg·kg-1。低、中、高劑量組的T1/2β分別為89.2，116.6，101.6min；AUC分別為6.9，12.7，24.9μg·mL-1·min；CL分別為0.03592，0.03942，0.0401L.mL-1·kg-1，格爾德霉素在Beagle體內(nèi)的藥代動力學(xué)符