氟對(duì)體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的： 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)綜合運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、細(xì)胞免疫組化技術(shù)、流式細(xì)胞儀技術(shù)及相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)等多種方法初次研究不同濃度的氟對(duì)體外培養(yǎng)的臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)與功能的影響，觀察不同氟濃度與血管內(nèi)皮細(xì)胞活性與功能的關(guān)系，為探討微量元素氟對(duì)人體的影響與作用提供有效的實(shí)驗(yàn)支持，豐富對(duì)氟的實(shí)驗(yàn)研究。 材料與方法： 1、培養(yǎng)：以含有10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株。304(HLJECV-304)

2、，傳代待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)穩(wěn)定后進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。 2、制備單細(xì)胞懸液密度為0.8～1.0×10<'5>個(gè)/ml，種24孔板，待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的氟化鈉溶液，每板均設(shè)對(duì)照組，于4、8、12、24、48小時(shí)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況及細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，留取培養(yǎng)液待測(cè)。 3、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況：在氟處理后的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔添加MTT試劑20μl(5m/ml)，37℃孵育4h、8h、12h、24h及48h后終止培養(yǎng)

3、，小心棄去培養(yǎng)液，用胰酶消化細(xì)胞，每孔加入15μl二甲基亞砜(DMSO)溶解，振蕩10min。用酶標(biāo)分析儀在490nm波長(zhǎng)下測(cè)其光吸收值(A)，可間接反映細(xì)．胞增殖情況。 4、免疫組織化學(xué)：將消毒好的蓋玻片放入24孔培養(yǎng)板，接種細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后加入各實(shí)驗(yàn)因素，培養(yǎng)24h后終止。除去培養(yǎng)液，PBS沖洗，滴加一抗二抗，顯色前用鑷子小心將蓋玻片取出進(jìn)行．DAB顯色，觀察PCNA，Ki-67的表達(dá)。 5、流式細(xì)胞術(shù)：待測(cè)細(xì)胞經(jīng)

4、離心-PBS沖洗-吹勻-固定-再離心-沖洗一吹打一染色(4℃，20～30分鐘)后，400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。Cell quest分析軟件分析，用細(xì)胞分裂增殖指數(shù)(PI)表示相對(duì)增殖活力。PI=(S+G<,2>/M)/(G<,0>/G<,1>+S+G<,2>/M)。 6、代謝功能檢測(cè)：利用試劑盒對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化酶丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和超氧化物岐化酶(SOD)進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果： 1、培養(yǎng)

5、4h～48h時(shí)，120～240umol/L劑量組對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力有明顯刺激作用，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)目增多，隨著氟作用時(shí)間的延長(zhǎng)及氟濃度的增加，刺激細(xì)胞增殖的能力明顯減弱，在720～96μtmol/L劑量時(shí)細(xì)胞改變最為明顯，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形、星形，似成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞收縮，細(xì)胞間隙加寬，胞漿中出現(xiàn)暗色顆粒。 2、加氟培養(yǎng)后24h血管內(nèi)皮細(xì)胞免疫組化顯示120～240μmol/L劑量組的血管內(nèi)皮細(xì)

6、胞PCNA、Ki-67表達(dá)陽(yáng)性率升高，表達(dá)率約為80﹪，而對(duì)照組及其480～60μmol/L劑量組表達(dá)相對(duì)較弱，約為40～45﹪，而720～96μmol/L劑量組表達(dá)率較低僅為20﹪左右。 3、加氟培養(yǎng)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受到了一定影響，MDA、SOD及NO含量發(fā)生了變化：隨著氟濃度的逐漸升高，MDA的含量逐漸升高，NO的含量逐漸下降。SOD的含量在低濃度和作用時(shí)間不長(zhǎng)時(shí)稍有增高，隨后開始下降。 結(jié)論： 1、體外