TagMan探針逆轉錄—實時熒光定量PCR技術測定喉癌組織中EGFR mRNA含量.pdf

1、表皮生長因子受體(EGFR)的過度表達和不恰當激活被認為與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,尤其在頭頸部腫瘤中EGFR表達上調(diào)最普遍,約占80﹪-100﹪.關于喉癌組織EGFR表達的研究在國內(nèi)外文獻中已有較多記錄.大部分研究報道喉癌組織中EGFR過度表達,但是也有報道EGFR在癌組織和癌旁正常組織中表達無明顯差異.以往的研究大多采用免疫組織化學染色或RT-PCR半定量技術,這些方法在定量方面仍有缺陷,不同的研究結論很可能是由于喉癌組織EGFR

2、表達水平的定量研究仍缺乏準確客觀的方法的緣故.TagMarl探針逆轉錄一實時熒光定量PCR技術是用于mRNA擴增定量檢測的一項新技術,與RT-PCR半定量分析、Northern印跡法等傳統(tǒng)mRNA定量方法相比,具有特異性高、穩(wěn)定性好和高通量等優(yōu)點.本研究運用該技術測定喉癌及癌旁組織學正常的喉黏膜組織中EGFR mRNA的表達水平,探討其應用價值. 1.組織標本 材料和方法收集2003年6月至2005年9月在浙江大學醫(yī)學院

3、附屬第二醫(yī)院耳鼻咽喉科住院手術的部分喉癌病例的切除組織標本.共32例,均為男性,年齡40-73歲,中位年齡為57.5歲.病理診斷均為鱗狀細胞癌,包括低分化4例,中分化19例,高分化9例.根據(jù)國際抗癌協(xié)會(UICC)和美國癌癥聯(lián)合會(AJCO TNM分類標準(2002)第六版:Ⅰ期5例,Ⅱ期12例,Ⅲ期8例,Ⅱ期7例.所有病例均為初發(fā)患者,術前未接受放化療.從手術切除標本中切取小塊癌組織和癌旁陰性切緣以外的喉黏膜組織,置于預先高壓滅菌的的

4、凍存管中,立即置于液氮中并保存于-80℃冰箱. 2.方法 以Primer Express Software v2.0軟件設計EGFR的引物探針.構建重組pGEM-T Easy/E6FR質粒,測序鑒定后將質粒按10倍濃度梯度稀釋成標準品. 所有組織樣本以Trizol法提取組織中總RNA,常規(guī)方法逆轉錄,合成cDNA,將組織樣本cDNA和按10倍濃度梯度稀釋的質粒DNA pGEM-T Easy/EGFR標準品(10<

5、'4>copies/ul-10<'7>copies/ul)以及陰性對照(ddH<,2>O)在實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)2.0版上以最佳PCR條件進行EGFR檢測,同時以GAPDH為內(nèi)參照.3數(shù)據(jù)分析以相對定量法計算EGFR mRNA含量,EGFR mRNA的相對含量=2<'-△cr>(ACT=EGFR的CT值-GAPDH的CT值).所得數(shù)據(jù)以SPSS 12.0統(tǒng)計軟件包進行處理,經(jīng)正態(tài)性檢驗,數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布,故結果用中位數(shù)(四分位數(shù)間距

6、),即M(QR)表示.以Wilcoxon秩和檢驗進行差異顯著性檢驗.重組pGEM-T Easy/EGFR質粒經(jīng)測序鑒定,與Genbank中的EGFRf芋列進行比對,與預期完全一致.應用TagMan探針實時熒光定量PCR技術測定EGFR mRNA含量的方法構建成功.喉癌組織中EGFR mRNA相對含量中位數(shù)為0.025,其四分位數(shù)間距為0.076;癌旁組織學正常喉黏膜的EGFR mRNA相對含量中位數(shù)為0.008,其四分位數(shù)間距為0.02