天花粉蛋白誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞骨架的改變和cAMP信號通路的調(diào)控.pdf

1、天花粉蛋白(TCS)具有多種藥理學(xué)特性，包括中期流產(chǎn)、抗人HIV病毒和誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡的抗腫瘤活性。已有研究結(jié)果表明，TCS誘導(dǎo)JAR內(nèi)ROS產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度波動、caspase-3活化和凋亡；TCS抑制HSV-1感染的Vero細(xì)胞內(nèi)MAPK和Bc1-2信號通路，進而抑制細(xì)胞復(fù)制。此外，TCS通過抑制PKC活性而誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。 我們實驗室的研究發(fā)現(xiàn)，TCS能夠誘導(dǎo)Hela細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，包括微絨毛消失、細(xì)胞膜發(fā)

2、泡，染色質(zhì)濃縮和凋亡小體形成；TCS抑制細(xì)胞增殖的機制與細(xì)胞周期S期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)capsase凋亡通路活化有關(guān)。這些研究結(jié)果初步證實Hela細(xì)胞是TCS的敏感細(xì)胞之一，但Tcs誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡過程中的細(xì)胞和分子機制仍需做深入的研究。 鑒于此，本課題在原有的實驗基礎(chǔ)上，進一步研究了TCS誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞骨架的改變、相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或靶點、轉(zhuǎn)錄因子環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)結(jié)合蛋白(CREB)在調(diào)節(jié)Bc1-2蛋白表達(dá)水平的

3、作用，以便從細(xì)胞和分子水平上揭示TCS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的機理，為天花粉蛋白在腫瘤防治中的應(yīng)用，提供重要的理論和實驗依據(jù)。 研究目的通過研究TCS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞骨架的排列、骨架蛋白和基因表達(dá)的改變、以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或靶點，闡明TCS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡的細(xì)胞和分子機制。 研究方法:采用CCK-8的方法，檢測TCS對HcLa細(xì)胞的抑制作用；在confocal免疫熒光顯微鏡下，觀察TCS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞

4、內(nèi)細(xì)胞骨架微管(MT)和微絲(MF)的改變：利用western blot檢測TCS對細(xì)胞骨架蛋白表達(dá)的影響，real-timePCR檢測TCS對細(xì)胞骨架actin和tubulin亞型基因表達(dá)的影響：電子顯微鏡和Annexin／PI雙染觀察TCS對HcLa細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用；Fura-4熒光探針檢測TCS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平的改變；腺苷酸環(huán)化酶(AC)、PKA、PKC、ERK、p38-MAPK蛋白激酶抑制劑或激活劑檢測這些激酶在T

5、CS抑制HeLa細(xì)胞增殖中的作用；用反義環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)結(jié)合蛋白(CREB)核苷酸敲除法和cAMP反應(yīng)原件(CRE)誘騙(decoy)寡核苷酸(ODN)法，驗證TCS是否通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子CREB對Bc1-2蛋白的表達(dá)產(chǎn)生影響。 研究結(jié)果:(1)TCS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡伴隨著MF解聚和質(zhì)膜下“環(huán)狀"MT結(jié)構(gòu)的形成；TCS抑制細(xì)胞骨架actin和tubulin亞型基因的表達(dá)，但不影響actin，α-tubulin和β-tubulin

6、蛋白的表達(dá)。(2)鈣離子螯合劑破壞TCS誘導(dǎo)的"環(huán)狀”MT結(jié)構(gòu)，但不影響TCS引起的MF解聚；而且鈣離子螯合劑和TCS聯(lián)合處理，顯著性增加LDH的釋放。(3)TCS誘導(dǎo)的細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流，抑制細(xì)胞內(nèi)腺苷酸環(huán)化酶的活性和細(xì)胞內(nèi)cAMP的形成；PKC活化劑顯著性拮抗TCS抑制的腺苷酸環(huán)化酶的活性和細(xì)胞內(nèi)cAMP的水平；TCS抑制的p-CREB表達(dá)能夠被cAMP異構(gòu)體拮抗；然而，PKC／ERK／MAPK抑制劑阻滯了cAMP異構(gòu)體的拮抗效應(yīng)。(

7、4)反義CREB核苷酸敲除法和CRE誘騙ODN法，有效阻滯了TCS對Bc1-2蛋白的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)論:(1)TCS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡伴隨著MT"環(huán)狀"結(jié)構(gòu)的形成和抑制細(xì)胞骨架actin和tubulin亞型基因的表達(dá)，但不影響actin和tubulin蛋白表達(dá)的改變。(2)TCS誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的升高參與調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞內(nèi)MT“環(huán)狀"結(jié)構(gòu)的形成與凋亡過程中細(xì)胞膜的完整性。(3)TCS誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高，參與抑制Hela細(xì)胞內(nèi)c