基于肺炎衣原體核糖核酸酶HII酶促反應(yīng)的單核苷酸多態(tài)性分型檢測技術(shù).pdf

1、單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是一種在基因組水平上由于單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性。SNP密度高，遺傳穩(wěn)定，非常適合構(gòu)建最精細的遺傳圖譜；SNP連鎖分析能夠確定致病基因的變異，反映個體之間的遺傳差異，為基因診斷、基因治療、個性化藥物的開發(fā)和使用提供遺傳信息。目前已經(jīng)發(fā)展多種SNP分型檢測技術(shù)，但是很多技術(shù)需要精密儀器，而且檢測成本比較高。開發(fā)操作簡便的低成本SNP分型技術(shù)是眾多

2、研究者追尋的目標(biāo)。 RNaseH是一類特異性降解RNA-DNA/DNA或者RNA/DNA雜合雙鏈中RNA鏈的核糖核酸酶，酶切產(chǎn)生具有5’磷酸末端和3’羥基末端的RNA片段。根據(jù)氨基酸序列特征可將RNaseH分為兩個主要家族，1型RNaseH和2型RNaseH。 衣原體(Chlamydiapneumoniae)的基因組序列分析表明衣原體沒有編碼1型RNaseH的基因，但有兩個序列不同的編碼2型RNaseH的基因：CP064

3、5和CP0782，(表達的蛋白分別命名為CpRNaseHII和CpRNaseHIII)?？寺pRNaseHII和CpRNaseHIII基因，表達并純化得到有活性的CpRNaseHII和CpRNaseHIII蛋白。CpRNaseHII和CpRNaseHIII的活性有所不同。CpRNaseHII在12-bpRNA/DNA底物的多個位點發(fā)生切割，而CpRNaseHIII只在這種底物的一個位點發(fā)生切割；CpRNaseHII酶切12-bpRNA

4、/DNA底物的最適Mg2+或Mn2+濃度分別為1mM和0.1mM，并且Mg2+的活性促進作用高于Mn2+，而CpRNaseHIII酶切12-bpRNA/DNA底物的最適Mg2+或Mn2+濃度均為10mM。CpRNaseHII能夠酶切21-bpDNA-rN1-DNA/DNA嵌合雙鏈，而且酶切效率不受核糖核苷酸類型的影響，而CpRNaseHIII不能夠切割這種底物；CpRNaseHII酶切21-bpDNA-rN1-DNA/DNA底物的最適鎂

5、離子濃度是10mM。 在DNA-rN1-DNA/DNA底物的不同位點引入錯配堿基，研究CpRNaseHII酶切攜帶錯配堿基的DNA-rN1-DNA/DNA嵌合底物的酶切速率。發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜飻y帶錯配堿基時，CpRNaseHII酶切錯配底物的酶促反應(yīng)速度低于正確配對底物，即錯配堿基的存在能夠降低CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度。錯配堿基位于底物不同位點時，CpRNaseHII酶切錯配底物的酶促反應(yīng)速度有很大不同。錯配堿基距離核糖核苷酸越

6、遠，CpRNaseHII酶切錯配底物的酶促反應(yīng)速度越接近正確配對底物。錯配堿基位于核糖核苷酸位點(0)或者位于緊挨核糖核苷酸的脫氧核糖核苷酸位點(-1或者+1)時，CpRNaseHII酶切錯配底物的酶促反應(yīng)速度最低。因此CpRNaseHII酶切錯配底物的酶促反應(yīng)速度與錯配堿基距離核糖核苷酸的相對距離成反比。 在0，-1或者+1位點引入不同的錯配堿基，結(jié)果表明錯配堿基位于0位點或者緊挨核糖核苷酸的5’端(-1)時，比起錯配堿基緊挨

7、核糖核苷酸的3’端(+1)，CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度受到更顯著影響。不同的錯配堿基位于DNA-rN1-DNA/DNA底物相同位點時，CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度不同，即錯配堿基的類型與CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度有密切關(guān)系。錯配堿基對CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度的影響可能是因為錯配堿基的存在能夠影響底物的構(gòu)型，不同的錯配堿基造成底物不同的構(gòu)型變化，導(dǎo)致CpRNaseHII酶促反應(yīng)速度產(chǎn)生很大差異。 研究表明C

8、pRNaseHII酶切DNA-rN1-DNA/DNA嵌合底物的酶切效率不受核糖核苷酸類型的影響，且CpRNaseHII酶切核糖錯配底物的酶促反應(yīng)速度遠遠低于配對底物。根據(jù)CpRNaseHII這一特點，建立一種新型的SNP分型檢測技術(shù)-CpRNaseHII酶切法，區(qū)分DNA-rN1-DNA/DNA的單堿基突變，力求達到簡單檢測SNP的目的。 CpRNaseHII酶切法分型SNP技術(shù)是以5’端熒光基團標(biāo)記，3’端淬滅基團標(biāo)記的分子信

9、標(biāo)作為檢測探針，利用CpRNaseHII對檢測探針酶切效率的差異導(dǎo)致的熒光信號的強弱來達到SNP分型檢測的目的。該分型方法的探針為中間嵌合一個核糖核苷酸的DNA-rN1-DNA分子信標(biāo)(cMB)。目標(biāo)單鏈DNA分子(ssDNA)與cMB分子雜交形成正確配對或錯配的CpRNaseHII底物。如果cMBs與目標(biāo)單鏈DNA分子正確配對，CpRNaseHII切割配對底物，發(fā)出的熒光可以實時檢測。第一輪酶切之后，過量的cMB分子與從酶促反應(yīng)復(fù)合物

10、中釋放出來的目標(biāo)單鏈DNA分子雜交，起始第二輪酶促反應(yīng)，這樣更多的熒光信號被釋放出來。相反，如果cMBs與目標(biāo)單鏈DNA分子形成的底物含有堿基錯配，錯配底物幾乎不能或很少被酶切，目標(biāo)單鏈DNA片段不能被有效釋放出來，阻止CpRNaseHII對過量cMBs分子進一步酶切和熒光信號的積聚。因此可以根據(jù)檢測的熒光信號強度對SNP位點進行分型檢測。 CpRNaseHII酶切法對所有錯配均可有效區(qū)分識別，它可以檢測1680-nt之內(nèi)的ss

11、DNA，這些ssDNA片段的長度對SNP的分型檢測沒有影響。CpRNaseHII酶切法檢測SNP時，目標(biāo)片段拷貝數(shù)不變的情況下，增大檢測探針的摩爾數(shù)，match/mismatch熒光信號比值增大，這能夠提高SNP分型檢測的有效性和準(zhǔn)確性。利用CpRNaseHII酶切法對人HLA基因上的9個SNP位點進行基因分型，并且利用DNA測序技術(shù)驗證CpRNaseHII酶切法分型SNP的準(zhǔn)確性。由于cMBs設(shè)計簡單，加上分型操作只是反應(yīng)底物的簡單添