骨質(zhì)疏松骨折骨不連相關(guān)因素的研究.pdf

1、隨著老齡化的增加，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率逐年增加。骨質(zhì)疏松是一種多病因的病理性改變，以單位體積內(nèi)骨組織量的減少、骨小梁結(jié)構(gòu)破壞為特征，可引起骨脆性增加及易于骨折的全身代謝性疾病。由于骨脆性增加，輕微外力便可導(dǎo)致骨折。目前隨著交通的發(fā)展及老年人社會活動的增加，老年性骨折的特點(diǎn)發(fā)生很大變化，除常見輕微外力造成的干骺部骨折外，暴力造成的骨干骨折的發(fā)生率明顯增加。由于骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨骼質(zhì)量下降，骨折周圍軟組織的損傷等因素，骨不連發(fā)生率明顯增加。目前對

2、骨質(zhì)疏松骨折骨不連的研究甚少，尚未見關(guān)于骨質(zhì)疏松骨折骨不連模型建立的報(bào)道。
　　本研究通過建立骨質(zhì)疏松模型，進(jìn)一步建立骨質(zhì)疏松骨不連模型，并通過骨不連斷端影像學(xué)和組織學(xué)觀察，確定骨不連模型的建立。待模型建成后，對骨折斷端加壓，進(jìn)一步對骨不連骨斷端成骨因子(BMP、VEGF、TGF)測定，并進(jìn)行影像學(xué)和組織學(xué)觀察，與骨不連模型比較，得出骨質(zhì)疏松骨折骨不連斷端機(jī)械應(yīng)力有利于骨折愈合，為機(jī)械性應(yīng)力作用于骨斷端促進(jìn)骨折愈合提供相應(yīng)的理論依

3、據(jù)。
　　主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果
　　1.骨質(zhì)疏松模型的建立實(shí)驗(yàn)組（OVX組）:將6月齡雌性SD大鼠，用10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉，麻醉成功后，背部剪毛，碘伏消毒術(shù)野，鋪洞巾，自雙側(cè)肋脊角外下各1cm處縱形切口，逐層分離，打開腹腔，視野中可見一乳白色的脂肪團(tuán)，卵巢即包埋其中，以小鑷子輕輕夾住脂肪團(tuán)拉出切口外，分離脂肪團(tuán)，可見粉紅色豆粒大小的卵巢。剪取時(shí)，先將卵巢下輸卵管（包括脂肪）用手術(shù)線結(jié)扎，再摘除卵巢，術(shù)

4、后順勢將子宮送回腹腔中，同法摘除另一側(cè)卵巢。慶大霉素注射液0.3mL(4萬u/mL)+生理鹽水0.6mL(1∶2)沖洗切口，關(guān)閉腹腔。
　　對照組（SHAM組）:將6月齡雌性SD大鼠，用10％水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射麻醉，麻醉成功后僅切除卵巢附近與之等量的脂肪組織。術(shù)后所有大鼠肌注青霉素，持續(xù)3天，以預(yù)防感染。標(biāo)準(zhǔn)飲食，常規(guī)分籠飼養(yǎng)3月后將實(shí)驗(yàn)組與對照組老鼠處死，通過骨密度、血清學(xué)檢測、大鼠體重及股骨濕重、干重、灰重的

5、測定等指標(biāo)鑒定骨質(zhì)疏松。
　　2.骨質(zhì)疏松骨折骨不連模型建立骨質(zhì)疏松大鼠模型建立后，所有大鼠腹腔注射10％水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉，手術(shù)區(qū)用碘伏消毒，鋪單，以股骨中段為中心，沿股骨長軸做縱行切口，切開皮膚，沿肌間隙鈍性分離至股骨表面，盡量保留骨膜，先自小轉(zhuǎn)子與第三轉(zhuǎn)子之間依次鉆孔，然后自股骨髁遠(yuǎn)端向近端方向，依次鉆孔，打入帶螺紋的克氏針，環(huán)形線鋸截?cái)喙晒?，將四根克氏針套入自制可調(diào)節(jié)加壓式外固定架（圖5），調(diào)整斷端距離d

6、=6mm，并使擰緊螺絲，用生理鹽水沖洗斷端髓腔，逐層縫合，術(shù)后青霉素肌肉注射，連續(xù)3天，分籠飼養(yǎng)12周。
　　2.1 X線檢查:
　　在0、2、4、8、10、12周觀察骨折斷端無連續(xù)性骨痂形成，到術(shù)后12周時(shí)影像學(xué)顯示骨折斷端髓腔骨性封閉，兩斷端處于同一水平面上，外固定支架穩(wěn)定。
　　2.2 HE染色:
　　術(shù)后2周斷端周圍少量細(xì)胞核深染的成骨樣細(xì)胞，周圍有大量的炎癥反應(yīng)細(xì)胞;術(shù)后4周，斷端周圍成骨樣細(xì)胞增多，并

7、出現(xiàn)一定數(shù)量的軟骨細(xì)胞，斷端之間充滿大量炎性細(xì)胞;術(shù)后8周，斷端周圍有少量細(xì)胞核深染的成骨樣細(xì)胞及大量肥大軟骨樣細(xì)胞，斷端之間出現(xiàn)大量梭形、橢圓形的成纖維細(xì)胞;術(shù)后10周，斷端出現(xiàn)大量不規(guī)則的編織樣骨;術(shù)后12周，斷端髓腔封閉，周圍分布少量成骨細(xì)胞，斷端見大量梭形的成纖維細(xì)胞。
　　3.骨質(zhì)疏松骨折骨不連斷端機(jī)械應(yīng)力實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組（加壓組）:如圖5所示，螺帽1可自由滑動，有固定滑塊2的作用，從而維持活動塊2與3之間的固定距離。在加壓的

8、第1個(gè)月，調(diào)節(jié)螺旋桿，通過特定的卡尺計(jì)量并縮短2mm的距離，每天通過食物刺激的方法誘使大鼠高強(qiáng)度活動。每次持續(xù)10分鐘，間歇30分鐘，每天10個(gè)循環(huán)。加壓的第2個(gè)、第3個(gè)月，均在原來基礎(chǔ)上縮短2mm，加壓方法同前所述。對照組:調(diào)節(jié)螺帽1，固定滑塊2，維持2、3之間的距離在三個(gè)加壓時(shí)間點(diǎn)內(nèi)保持不變(d=6mm)，其它方法同上所述。
　　3.1 X線檢查對照組:在4、8、12周觀察骨不連斷端無骨痂生成，間隙仍然存在，斷端呈杵棒樣改變。

9、
　　實(shí)驗(yàn)組:加壓后4周，隨著斷端間隙縮短，斷端間隙呈模糊狀改變，部分釘?shù)乐車泄悄は鲁晒切纬?加壓后8周骨折斷端間隙出現(xiàn)絮狀模糊影，部分樣本在單側(cè)皮質(zhì)間有新骨形成;12周時(shí)斷端間隙縮短，呈模糊狀改變，或出現(xiàn)一側(cè)的骨性連接，或單側(cè)明顯的成骨反應(yīng)，與加壓后4周、對照組比較有顯著差異(p＜0.05);12周影像學(xué)評分較前兩次、對照組有顯著差異(p＜0.05)。
　　3.2 加壓4、8、12周后，行免疫組化染色對照組:在4、8、1

10、2周時(shí)骨不連斷端BMP、VEGF、TGFβ仍有表達(dá)，但無峰值變化，呈低表達(dá)狀態(tài)。
　　實(shí)驗(yàn)組（加壓組）:加壓后4周，BMP、VEGF、TGFβ陽性表達(dá)增多，到加壓后8周，BMP陽性表達(dá)顯著增多，VEGF、TGFβ呈持續(xù)表達(dá);12周時(shí)TGFβ陽性表達(dá)增多。
　?、?BMP:加壓后4周，BMP局部表達(dá)明顯高于對照組(p＜0.05)，到8周時(shí)，其表達(dá)出現(xiàn)短暫的峰值，與前后兩次測量比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05);到12周時(shí)，其表達(dá)

11、量下降，但仍高于對照組(p＜0.05)。
　?、?VEGF;加壓早期出現(xiàn)高峰，較后兩次測量值比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。8周、12周其表達(dá)量無明顯差異，但均高于對照組測量值(p＜0.05)。
　　③.TGFβ檢測:加壓后其表達(dá)量高于對照組(p＜0.05)，但組內(nèi)前后三次測量值相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.3 鈣鈷法堿性磷酸酶染色:
　　對照組:在4、8、12周骨不連斷端仍有一定數(shù)量的成骨細(xì)胞表達(dá)，但其數(shù)量較

12、少。
　　實(shí)驗(yàn)組:加壓4周后局部成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多，較對照組變化明顯(p＜0.05)，第8周時(shí)呈上升趨勢，與前后兩個(gè)時(shí)期比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯(p＜0.05);到12周時(shí)，成骨細(xì)胞數(shù)量降低。
　　3.4 熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)機(jī)械性應(yīng)力作用下，BMP、VEGF在不同時(shí)期的的基因擴(kuò)增明顯高于對照組(p＜0.05); VEGF基因擴(kuò)增在加壓后4周出現(xiàn)峰值，較8周、12周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05;圖8-3）

13、;BMP基因擴(kuò)增在加壓后8周出現(xiàn)峰值，較4、12周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.05;圖7-3）;而TGFβ在三個(gè)加壓期無明顯上升趨勢，仍高于對照組（p＜0.05;圖9-3）
　　結(jié)論：
　　1.通過應(yīng)用自制的可調(diào)式外固定支架，可建成骨質(zhì)疏松骨折骨不連模型。
　　2.骨質(zhì)疏松骨折骨不連局部存在相應(yīng)的成骨因子，但呈低表達(dá)狀態(tài)。
　　3.機(jī)械應(yīng)力作用可增加骨質(zhì)疏松骨折骨不連斷端相應(yīng)成骨因子的表達(dá)。
　　4.組織學(xué)觀