熒光定量PCR對(duì)小兒肺炎支原體感染早期診斷價(jià)值和臨床意義的研究.pdf

1、目的： 肺炎支原體是下呼吸道感染及社區(qū)獲得性肺炎的常見(jiàn)原因，在兒童引起了大約6-20％的后天免疫性肺炎及下呼吸道感染。根據(jù)種群及已知的診斷實(shí)驗(yàn)研究在后天免疫性肺炎及下呼吸道感染中肺炎支原體的發(fā)病率占1-30％，支原體培養(yǎng)非常困難，因此，傳統(tǒng)上臨床診斷主要依靠血清學(xué)方法，在急性期血清學(xué)方法敏感性欠佳，有恢復(fù)期的標(biāo)本常使診斷更精確但需要起病后很多天，根據(jù)以往的血清學(xué)方法及已實(shí)驗(yàn)的人群其敏感性和特異性在55-100％，最近，分子技術(shù)發(fā)

2、展起來(lái)了，它對(duì)于肺炎支原體的病原診斷非常重要，因?yàn)樵谂R床上肺炎支原體同其他的細(xì)菌感染無(wú)明顯差別，對(duì)B內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素?zé)o效，在下呼吸道感染中常經(jīng)驗(yàn)性治療，為了及時(shí)有效的治療需要一個(gè)快速的診斷方法。同其他的方法相比，PCR法提供潛在的增高的敏感性和快速性，因此，對(duì)于肺炎支原體的診斷，很多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了核苷酸序列的擴(kuò)增技術(shù)。 FQ-PCR技術(shù)是近些年發(fā)展起來(lái)的新的核酸檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)把PCR的高靈敏性、DNA雜交探針的高特異性和光譜技術(shù)的

3、高精確定量融為一體。它出結(jié)果快，一般在2個(gè)小時(shí)內(nèi)，可以及時(shí)地提供給臨床，可以對(duì)病原定量，并且沒(méi)有普通PCR的后續(xù)處理步驟，與傳統(tǒng)PCR相比，明顯地降低了污染的發(fā)生，本研究旨在探討熒光定量PCR對(duì)小兒肺炎支原體感染的早期診斷價(jià)值和臨床意義，尤其是對(duì)于嬰幼兒及免疫能力差產(chǎn)生抗體不足者。 對(duì)象與方法: 一、研究對(duì)象的選取(一)實(shí)驗(yàn)組2006年10月～2007年3月我院兒科呼吸門(mén)診122例下呼吸系統(tǒng)感染者，其中男64例，女58例

4、；年齡2個(gè)月～14歲?！?歲：53例， 3歲-6歲：41例，≥6歲：28例。性別比例無(wú)顯著性差異。均以發(fā)熱咳嗽為主要癥狀，其中肺炎57例，支氣管炎65例。所有檢測(cè)對(duì)象檢測(cè)前3天均未用紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)生素。 (二)對(duì)照組 20例，同期于我院門(mén)診取無(wú)呼吸道感染的正常兒童咽拭子。年齡2個(gè)月-14歲，≤3歲8例，3-6歲7例，≥6歲5例，男11例，女9例。與實(shí)驗(yàn)組無(wú)性別及年齡差異。 二、方法 (一)主要儀器及試

5、劑SLAN熒光定量分析儀，超凈工作臺(tái)，離心機(jī)，振蕩器，肺炎支原體熒光定量PCR試劑盒，計(jì)算機(jī)，零下20度冰箱。 (二)標(biāo)本采集用無(wú)菌生理鹽水浸過(guò)的棉拭子直接擦拭咽后壁，然后浸于1毫升無(wú)菌生理鹽水中震蕩，密封冰盒運(yùn)送，零下20度保存，用以PCR檢測(cè)；就診當(dāng)天或第2天及相隔一周到兩周后采集靜脈血，用以明膠微量顆粒凝集法抗體測(cè)定。 (三)MP感染診斷標(biāo)準(zhǔn)雙份血清抗體有4倍以上升高或單次血清抗體滴度≥1：160作為肺炎支原體感染

6、診斷標(biāo)準(zhǔn)。 (四)檢測(cè) 1、從冰箱中取出標(biāo)本，解凍后提取DNA。 2、從冷藏室取出試劑盒，復(fù)溫至室溫。 3、啟動(dòng)SLAN熒光定量PCR分析儀，將樣品及陽(yáng)性質(zhì)控品陰性對(duì)照分別放入，分析軟件自動(dòng)得出實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線(xiàn)及計(jì)算結(jié)果。 (五)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析組間陽(yáng)性率比較用X2檢驗(yàn)，使用SPSS10.0軟件，P<0.05表示有顯著性差異。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、咽拭子FQ-PCR與顆粒凝集法檢出率比較在122

7、例患兒中FQ-PCR共檢出34例，顆粒凝集法共檢出30例，F(xiàn)Q-PCR的敏感性是86.67％，特異性是91.30％，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是76.47％，陰性預(yù)測(cè)值是97.67％，兩者符合率是90.16％，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，X2檢驗(yàn)，兩種方法無(wú)顯著性差異。(P>0.05 ) 二、咽拭子FQ-PCR與首次滴度<1：1 60的陽(yáng)性率比較在110例中首次滴度<1：160者中，雙份血清有4倍增高者有18例，其中FQ-PCR檢出16例，F(xiàn)Q-PCR與二次

8、血清抗體滴度升高的符合率為90.90％，因此，F(xiàn)Q-PCR可作為肺炎支原體感染的早期診斷手段，尤其是在疾病初期。 三、各年齡組檢出情況比較兩種方法均在6歲以上學(xué)齡兒童組檢出率最高，但FQ-PCR在嬰幼兒組亦有較高的檢出率。 四、對(duì)照組檢出情況在20例正常對(duì)照組中有1例FQ-PCR陽(yáng)性。 結(jié)論： 1、FQ.PCR與顆粒凝集法對(duì)于檢測(cè)小兒肺炎支原體感染有較好的符合率，具有較高的敏感性和特異性。 2、F