可溶性CD80分子免疫放射分析方法的建立及應(yīng)用研究.pdf

1、目的：建立可溶性共刺激分子CD80的免疫放射分析方法(IRMA)，探討其臨床應(yīng)用。 方法：①采用Iodogen法進行抗CD80單抗10D9的125I標(biāo)記，分別改變Iodogen的用量、抗體的用量、125I的活度及反應(yīng)時間，摸索在不同條件下標(biāo)記的效果，尋找一最佳標(biāo)記條件；標(biāo)記產(chǎn)物用SephadexG-50分離純化，三氯醋酸(TCA)法測定其標(biāo)記率和放化純：將125I-10D9與不同細胞數(shù)的人B細胞淋巴瘤Daudi細胞懸液在37℃細

2、胞培養(yǎng)箱中反應(yīng)，測定標(biāo)記物的免疫活性；將標(biāo)記物分別加入到生理鹽水、血清及0.05MpH7.4的PBS液(含1％BSA)中，另取標(biāo)記物不稀釋作為對照，分別置于37℃及4℃條件下，觀察放置3d、1w、2w、3w、4w、6w后標(biāo)記物的穩(wěn)定性。②采用物理吸附法制備單克隆抗體4E5的固相包被管，用不同濃度的抗體、不同pH的緩沖液包被試管，并選擇適宜的反應(yīng)溫度及時間、最佳封閉時間等，以確定最佳包被條件；將制備好的固相抗體分別放置于37℃及4℃條件下

3、，儲存1w、2w、4w、6w、8w后，測定其與抗原的免疫結(jié)合，觀察其穩(wěn)定性。③建立雙位點夾心可溶性CD80分子的IRMA，檢測各類自身免疫性疾病及腫瘤患者血清中的CD80含量并與正常對照組比較。 結(jié)果：①125I標(biāo)記10D9的最佳條件為：Iodogen用量10μg、10D9用量20μg、加入Na125I22.2MBq、室溫反應(yīng)8min，125I-10D9的標(biāo)記率和放化純達到最佳水平，標(biāo)記率為(84.10±3.18)％，放化純?yōu)?

4、98.49±1.14)％，比活度為933.51MBq/mg；125I-10D9與Daudi細胞的結(jié)合率隨細胞數(shù)的增加而增加，當(dāng)細胞數(shù)為1×107時結(jié)合率達到最高水平，此時總細胞結(jié)合率為(25.77±1.07)％，特異性細胞結(jié)合率為(23.15±1.07)％；標(biāo)記物加入到不同稀釋液中后，在4℃條件下，對照組及人血清組1w后、PBS組3w后放化純度仍大于90％；在37℃條件下，對照組3d后、人血清組1w后、PBS組2w后放化純度仍大于90％

5、；而生理鹽水組放置3d后放化純即明顯下降(P<0.01)。②4E5固相包被管制備的最佳條件為：用0.05MpH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋抗體4E5至8.0mg/L，室溫反應(yīng)24h:包被好的試管用2％的BSA封閉，封閉時間6～8h為佳；包被管在4℃條件下放置8w仍保持很好的穩(wěn)定性。③建立的可溶性CD80分子IRMA，其靈敏度為0.14μg/L，批內(nèi)變異系數(shù)為6.46％～7.87％，批間變異系數(shù)為7.89％～9.27％，回收率為86.64～1