復(fù)方甘草酸苷對(duì)暴發(fā)性肝衰竭小鼠模型血腦屏障通透性影響的研究.pdf

1、目的： 暴發(fā)性肝衰竭(FHF)是一種以凝血酶原時(shí)間延長(zhǎng)和肝性腦病為主要特征的臨床疾病，而腦水腫繼發(fā)腦疝是死亡的主要原因。目前研究表明，血管源性腦水腫和細(xì)胞毒性腦水腫可能同時(shí)參與FHF時(shí)腦水腫的形成過(guò)程。同時(shí)Hill DB等證實(shí)了血腦屏障(BBB)通透性增加是FHF引發(fā)血管源性腦水腫的主要發(fā)病機(jī)制。BBB結(jié)構(gòu)中最重要的是緊密連接(TJ)。目前關(guān)于TJ分子結(jié)構(gòu)的研究很多，但病理?xiàng)l件下TJ相關(guān)蛋白，尤其是對(duì)其功能調(diào)節(jié)蛋白o(hù)ccludi

2、n的研究還很少。 復(fù)方甘草酸苷(Glycyrrhizin)作為強(qiáng)有力的肝細(xì)胞膜保護(hù)劑，具有保護(hù)肝細(xì)胞、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制病毒、類(lèi)固醇激素樣等作用。有研究證實(shí)復(fù)方甘草酸苷可以通過(guò)降低細(xì)胞因子IL-1、IL-6及TNF-α水平對(duì)重癥肝炎小鼠發(fā)揮保護(hù)作用。本研究旨在弄清復(fù)方甘草酸苷能否通過(guò)改變occludin蛋白的分布或表達(dá)來(lái)影響血腦屏障的通透性。實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察FHF模型組和Glycyrrhizin處理組occludin蛋白的分布及表

3、達(dá)，來(lái)揭示復(fù)方甘草酸苷降低肝衰竭時(shí)血腦屏障通透性的保護(hù)作用。 材料與方法： 1、動(dòng)物模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為400只雄性Balb/c小鼠，隨機(jī)分為5組。1組：生理鹽水對(duì)照組，2組：內(nèi)毒素(LPS)對(duì)照組，3組：D氨基半乳糖(GalN)對(duì)照組，4組：暴發(fā)性肝衰竭模型組(LPS+GalN)，5組：保護(hù)組(LPS+GalN+Glycyrrhizin)。各組40只小鼠，其中20只檢測(cè)BBB通透性，另20只留血、腦組織和肝臟組

4、織待檢。 2、血清ALT水平的測(cè)定 應(yīng)用生物化學(xué)方法檢測(cè)血清ALT水平，以明確暴發(fā)性肝衰竭時(shí)肝臟功能生化學(xué)改變。 3、EB含量的測(cè)定 處死動(dòng)物前2h尾靜脈注射伊文思藍(lán)(EB)，取腦組織溶于甲酰胺，離心取上清于波長(zhǎng)632nm進(jìn)行比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出單位腦組織EB含量，以此評(píng)價(jià)BBB通透性的變化。 4、HE染色法觀察 對(duì)留取的肝、腦組織進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察各組病理形態(tài)學(xué)改變。

5、5、免疫組化檢測(cè) 應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)occludin蛋白在腦組織中的分布與表達(dá)。血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿內(nèi)棕褐色染色，或于細(xì)胞漿內(nèi)沿胞膜有棕褐色線形染色者為陽(yáng)性細(xì)胞。 6、Western blot方法 應(yīng)用Western blot方法對(duì)occludin蛋白的表達(dá)作半定量分析。 7、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 應(yīng)用Trizol試劑提取腦組織RNA，利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)occludin mRNA的表達(dá)作相對(duì)定量分析

6、。采用SYBR Green I熒光染料嵌合法，以構(gòu)建的RNA為標(biāo)準(zhǔn)品，分別對(duì)目的基因(occludin基因)和管家基因(GAPDH)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的目的基因和管家基因分別進(jìn)行定量。通過(guò)管家基因的校正，檢測(cè)各種樣品occludin mRNA的相對(duì)表達(dá)量。 8、數(shù)據(jù)處理 結(jié)果：用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并采用方差分析的方法，以P<0.05為差異具有顯著性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1、復(fù)方甘草酸苷在FHF動(dòng)

7、物模型中的作用： LPS/GaIN聯(lián)合注射后動(dòng)物出現(xiàn)懶動(dòng)，進(jìn)食能力下降，9h后血清ALT明顯升高，較其它對(duì)照組有顯著性差異(P<0.01)。肝臟出現(xiàn)出血性大塊或亞大塊肝壞死，病理改變類(lèi)似暴發(fā)性肝衰竭，總死亡率達(dá)70.6％。應(yīng)用Glycyrrhizin預(yù)先注射，動(dòng)物死亡率顯著下降至40％，血清ALT水平明顯降低，肝臟病理變化明顯減輕。 2、EB含量測(cè)定結(jié)果 暴發(fā)性肝衰竭組小鼠腦組織EB含量明顯增高，較其它對(duì)照組均

8、有顯著性差異(P<0.05)；在用Glycyrrhizin預(yù)先進(jìn)行保護(hù)后，腦組織中EB含量較暴發(fā)性肝衰竭組明顯降低(P<0.05)。 3、腦組織H染色 各組腦組織HE染色切片中未發(fā)現(xiàn)有明顯異常表現(xiàn)。 4、腦組織occludin蛋白的表達(dá)： 利用免疫組化方法檢測(cè)到在肝衰竭組中，血管內(nèi)陽(yáng)性染色明顯減弱，甚至在整張切片上很難見(jiàn)到陽(yáng)性染色信號(hào)。在western blot分析中，發(fā)現(xiàn)相同組中occludin蛋白的表

9、達(dá)量減弱，經(jīng)過(guò)Glycyrrhizin預(yù)先進(jìn)行保護(hù)后，腦組織內(nèi)免疫組化陽(yáng)性染色信號(hào)明顯增加，western blot分析也表明蛋白表達(dá)量明顯增加。 5、腦組織occludin mRNA的表達(dá) 利用熒光定量PCR法檢測(cè)occludin mRNA的相對(duì)含量，各組之間無(wú)顯著性差異 結(jié)論： 1、復(fù)方甘草酸苷預(yù)保護(hù)可阻斷小鼠FHF的發(fā)生，證明復(fù)方甘草酸苷對(duì)暴發(fā)性肝衰竭小鼠有保護(hù)作用。 2、復(fù)方甘草酸苷組腦組