復(fù)方甘草酸苷對暴發(fā)性肝衰竭小鼠模型血腦屏障通透性影響的研究.pdf

1、目的： 暴發(fā)性肝衰竭(FHF)是一種以凝血酶原時間延長和肝性腦病為主要特征的臨床疾病，而腦水腫繼發(fā)腦疝是死亡的主要原因。目前研究表明，血管源性腦水腫和細胞毒性腦水腫可能同時參與FHF時腦水腫的形成過程。同時Hill DB等證實了血腦屏障(BBB)通透性增加是FHF引發(fā)血管源性腦水腫的主要發(fā)病機制。BBB結(jié)構(gòu)中最重要的是緊密連接(TJ)。目前關(guān)于TJ分子結(jié)構(gòu)的研究很多，但病理條件下TJ相關(guān)蛋白，尤其是對其功能調(diào)節(jié)蛋白occludi

2、n的研究還很少。 復(fù)方甘草酸苷(Glycyrrhizin)作為強有力的肝細胞膜保護劑，具有保護肝細胞、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抑制病毒、類固醇激素樣等作用。有研究證實復(fù)方甘草酸苷可以通過降低細胞因子IL-1、IL-6及TNF-α水平對重癥肝炎小鼠發(fā)揮保護作用。本研究旨在弄清復(fù)方甘草酸苷能否通過改變occludin蛋白的分布或表達來影響血腦屏障的通透性。實驗通過觀察FHF模型組和Glycyrrhizin處理組occludin蛋白的分布及表

3、達，來揭示復(fù)方甘草酸苷降低肝衰竭時血腦屏障通透性的保護作用。 材料與方法： 1、動物模型制備 實驗動物為400只雄性Balb/c小鼠，隨機分為5組。1組：生理鹽水對照組，2組：內(nèi)毒素(LPS)對照組，3組：D氨基半乳糖(GalN)對照組，4組：暴發(fā)性肝衰竭模型組(LPS+GalN)，5組：保護組(LPS+GalN+Glycyrrhizin)。各組40只小鼠，其中20只檢測BBB通透性，另20只留血、腦組織和肝臟組

4、織待檢。 2、血清ALT水平的測定 應(yīng)用生物化學方法檢測血清ALT水平，以明確暴發(fā)性肝衰竭時肝臟功能生化學改變。 3、EB含量的測定 處死動物前2h尾靜脈注射伊文思藍(EB)，取腦組織溶于甲酰胺，離心取上清于波長632nm進行比色，根據(jù)標準曲線計算出單位腦組織EB含量，以此評價BBB通透性的變化。 4、HE染色法觀察 對留取的肝、腦組織進行HE染色，光鏡下觀察各組病理形態(tài)學改變。

5、5、免疫組化檢測 應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測occludin蛋白在腦組織中的分布與表達。血管內(nèi)皮細胞胞漿內(nèi)棕褐色染色，或于細胞漿內(nèi)沿胞膜有棕褐色線形染色者為陽性細胞。 6、Western blot方法 應(yīng)用Western blot方法對occludin蛋白的表達作半定量分析。 7、實時定量PCR檢測 應(yīng)用Trizol試劑提取腦組織RNA，利用實時定量PCR對occludin mRNA的表達作相對定量分析

6、。采用SYBR Green I熒光染料嵌合法，以構(gòu)建的RNA為標準品，分別對目的基因(occludin基因)和管家基因(GAPDH)制作標準曲線，利用標準曲線對樣品中的目的基因和管家基因分別進行定量。通過管家基因的校正，檢測各種樣品occludin mRNA的相對表達量。 8、數(shù)據(jù)處理 結(jié)果：用平均數(shù)±標準差表示，并采用方差分析的方法，以P<0.05為差異具有顯著性。 實驗結(jié)果 1、復(fù)方甘草酸苷在FHF動

7、物模型中的作用： LPS/GaIN聯(lián)合注射后動物出現(xiàn)懶動，進食能力下降，9h后血清ALT明顯升高，較其它對照組有顯著性差異(P<0.01)。肝臟出現(xiàn)出血性大塊或亞大塊肝壞死，病理改變類似暴發(fā)性肝衰竭，總死亡率達70.6％。應(yīng)用Glycyrrhizin預(yù)先注射，動物死亡率顯著下降至40％，血清ALT水平明顯降低，肝臟病理變化明顯減輕。 2、EB含量測定結(jié)果 暴發(fā)性肝衰竭組小鼠腦組織EB含量明顯增高，較其它對照組均

8、有顯著性差異(P<0.05)；在用Glycyrrhizin預(yù)先進行保護后，腦組織中EB含量較暴發(fā)性肝衰竭組明顯降低(P<0.05)。 3、腦組織H染色 各組腦組織HE染色切片中未發(fā)現(xiàn)有明顯異常表現(xiàn)。 4、腦組織occludin蛋白的表達： 利用免疫組化方法檢測到在肝衰竭組中，血管內(nèi)陽性染色明顯減弱，甚至在整張切片上很難見到陽性染色信號。在western blot分析中，發(fā)現(xiàn)相同組中occludin蛋白的表

9、達量減弱，經(jīng)過Glycyrrhizin預(yù)先進行保護后，腦組織內(nèi)免疫組化陽性染色信號明顯增加，western blot分析也表明蛋白表達量明顯增加。 5、腦組織occludin mRNA的表達 利用熒光定量PCR法檢測occludin mRNA的相對含量，各組之間無顯著性差異 結(jié)論： 1、復(fù)方甘草酸苷預(yù)保護可阻斷小鼠FHF的發(fā)生，證明復(fù)方甘草酸苷對暴發(fā)性肝衰竭小鼠有保護作用。 2、復(fù)方甘草酸苷組腦組